 |
55. Общая характеристика иммуноферментного анализа; преимущества и недостатки фермент-зависимых меток. Области применения ИФА.
|
|
|
|
55. Общая характеристика иммуноферментного анализа; преимущества и недостатки фермент-зависимых меток. Области применения ИФА.
ИФА – метод выявления Аг и Ат, основанный на определении комплекса Аг-Ат за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями.
Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител обладает следующими преимуществами:
· ↑ чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0, 05 нг/мл (определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата);
· возможностью использовать мин. объемы исследуемого материала;
· стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА;
· простотой проведения реакции;
· наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;
· отсутствием радиационной опасности;
· возможностью усиления сигнала;
· возможностью автоматизации всех этапов реакции относительно ↓ стоимостью диагностических наборов.
Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:
|
|
|
56. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему Ат, что ведет к образованию иммунного комплекса;
57. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
58. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.
Недостаток - относясь к непрямым методам диагностики, он позволяет определить иммунный ответ организма на возбудителя, а не самого возбудителя.
К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований:
а) высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях;
б) доступность ферментов; возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую ферментативную активность после химической модификации при получении конъюгата с антителами или антигенами;
в) стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;
г) простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.
Для ферментативной метки антигенов или антител могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза, β -галактозидаза и т. д. В качестве субстратного реагента наиболее часто применяется орто-фенилендиамин (ОФД) с перекисью водорода, продукт окисления которого регистрируется фотометрически. Для остановки ферментативной реакции применяют “стоп реагент”, который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве “стоп реагента” применяют H2SO4.
Чувствительность многих вариантов иммуноферментных методов анализа может быть ограничена наименьшей регистрируемой концентрацией ферментативной метки в растворе, поэтому чем в более низкой концентрации возможно определение меченного ферментом антигена или антитела, тем лучшими характеристиками будет обладать данный метод ИФА.
|
|
|
Области применения:
–Медицина: диагностика вирусных заболеваний (герпес), инфекции передающиеся половым путем (хламидиоз, сифилис), онкомаркеры, аллергология, эндокринология и т. д. Также ИФА применяется для анализа лекарственных средств, допинга; различных физиологических состояний организма (ранняя диагностика беременности, патологии протекания беременности).
–Ветеринария: три основные сферы применения иммунодиагностики на базе ИФА и агглютинации в ветеринарии: 1) оценка фертильности; 2) диагностика инфекционных заболеваний; 3) обнаружение токсинов и остаточных количеств различных веществ.
–С/х и др.
59. Нековалентные методы получения коньюгатов антитело-фермент. Метод гибридных антител. Использование авидини и биотина.
Можно выделить следующие наиболее эффективные подходы: 1) использование комплекса фермент—антитело против фермента;
2) введение ферментной метки через комплекс авидин — биотин.
Введение ферментной метки через комплекс со специфическими антителами против фермента наиболее часто применяется при использовании в качестве метки пероксидазы хрена. Этот анализ встречается в литературе под названием ПАП-метода (ПАП—пероксидаза—антипероксидаза).
В качестве примера приведем схему определения кроличьих антител против какого-либо антигена ПАП-методом. К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую пробу. После инкубации и отмывки не связавшихся компонентов к носителю добавляют антивидовые антитела (например, сыворотку крови осла, иммунизированного IgG кролика). Проводят повторную инкубацию, отмывку и вводят в систему антитела кролика против пероксидазы. Смесь инкубируют, носитель отмывают и на последней стадии добавляют пероксидазу, образующую специфический комплекс с соответствующими антителами, который выявляют обычными методами. Одним из вариантов схемы является добавление не антител против пероксидазы, а заранее приготовленного ПАП-комплекса.
Отметим, что ПАП-метод может быть формально отнесен к классифицированным ранее методам с использованием меченых антивидовых антител, только в данном случае используется не ковалентный конъюгат антивидовое антитело — фермент, а последовательно получаемый комплекс антивидовое антитело — антитело к пероксидазе — пероксидаза. Недостатком ПАП-метода является удлинение схемы анализа, частичное ингибирование пероксидазной активности при образовании комплекса с антителами, возможность диссоциации комплекса антитело—фермент при разведениях, промывках, изменениях рН и ионной силы среды.
|
|
|
Процедура анализа несколько упрощается по сравнению с ПАП-методом при использовании комплекса фермента с так называемыми гибридными антителами.
В результате ферментативного гидролиза получают (Fab') 2-фрагменты антител против определяемого антигена и используемого фермента. Смешивают продукты гидролиза и подвергают их воздействию восстанавливающего агента (например, меркаптоэтанола), вследствие чего (РаЬ')2-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента происходит рекомбинация Fab-фрагментов, в результате чего наряду с исходными образуются гибридные (РаЬ'Ь-фрагменты, один активный центр которых специфичен к детерминантам антигена, а второй — фермента.
При добавлении фермента образуется комплекс (Fab') 2-фер-мент, который может применяться для определения антигена в рассмотренных выше методах ИФА с использованием меченых специфических антител (например, в «сэндвич»-методе). При необходимости ферментная метка может вводиться после взаимодействия гибридного антитела с определяемым антигеном. Хотя этот подход был предложен около 20 лет назад и привлекает своей «элегантностью», он не нашел практического применения из-за трудоемкости получения реагентов.
Следующий метод нековалентного введения ферментной метки в гетерогенном ИФА антигенов и антигел основан на использовании авидина (основной гликопротеид, компонент яичного белка) и биотина, образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 М-1, что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген — антитело. Один из вариантов ИФА антител с использованием этой техники может быть проведен по схеме.
|
|
|
Иммобилизованный антиген инкубируют с пробой, содержащей антитела, отмывают и добавляют антивидовые антитела, ковалентно связанные с биотином. Затем вносят авидин, образующий прочный комплекс с биотином, отмывают избыток белка и добавляют фермент с ковалентно пришитым биотином, который взаимодействует с другим центром связывания авидина. (Другим путем является использование антивидовых антител, ковалентно связанных с авилином, что упрощает анализ и сокращает его длительность. Достоинствами данного подхода являются универсальность конъюгата, используемого для анализа различных антигенов, и повышение чувствительности регистрации образуемого иммунохимического комплекса. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что при синтезе конъюгата антитело—биотин с одной молекулой антитела может быть ковалентно связано до 90 молекул биотина. Молекула авидина имеет четыре центра связывания биотина, поэтому каждый специфический иммунохимический комплекс с участием определяемых антител на конечной стадии анализа будет содержать не одну молекулу фермента, а несколько десятков, что приводит к существенному выигрышу в чувствительности определения метки, а следовательно, и всего анализа.
|
|
|
