 |
Работа 28. Прямой счет микроорганизмов почвы под микроскопом
|
|
|
|
Работа 28. Прямой счет микроорганизмов почвы под микроскопом
Метод прямого счета микроорганизмов С. Н. Виноградского и модификации О. Г. Шульгиной позволяет более точно учесть численность микроорганизмов в почве, нежели методы высева почвенной суспензии на агаризованные питательные среды. В свою очередь точный учет численности микроорганизмов в почве дает более полное представление о ее биогенности. Однако следует иметь в виду, что при работе данным методом получаются несколько завышенные результаты, так как на препаратах не удается дифференцировать живые и мертвые клетки микроорганизмов.
Материалы и оборудование
Ступка, резиновая перчатка, спиртовка, часовое стекло, весы, разновесы, скальпель, пинцет, колба, содержащая 45 мл стерильной дистиллированной воды, исследуемая почва, микропипетки на 0, 1—0, 2 мл, обезжиренные предметные стекла, 5%-ный раствор карболового эритрозина, абсолютный спирт или 2%-ный раствор осмиевой кислоты, микроскоп.
Ход работы
Небольшое количество исследуемой почвы растирают в течение 10 мин в ступке пальцем в резиновой перчатке. На часовом стекле отвешивают 5 г почвы и переносят ее в колбу, содержащую 45 мл стерильной воды, получают разведение 1/10. Если анализируемая почва характеризуется высокой численностью микроорганизмов, готовят следующее разведение. В колбу № 2, содержащую 90 мл стерильной воды, пипеткой приливают 10 мл почвенной суспензии из колбы № 1, получают разведение 1/100.
Содержимое колбы встряхивают в течение 5 мин, затем дают крупным частицам отстояться 3—5 с и стерильной микропипеткой переносят 0, 01—0, 02 мл почвенной суспензии на обезжиренное предметное стекло, равномерно распределяя ее на площадь 4 см2. Квадрат на стекле вычерчивают заранее алмазом, подложив под стекло миллиметровую бумагу.
|
|
|
Приготовленный препарат высушивают на воздухе, фиксируют на пламени либо абсолютным спиртом 5 мин, либо парами 2%-ного раствора осмиевой кислоты 2—4 мин. Далее препарат окрашивают карболовым эритрозином 30—40 мин и более в зависимости от качества красителя. Эритрозин хорошо окрашивает бактериальные клетки и не окрашивает почвенные частицы. Окрашенный препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. Конденсор микроскопа тоже обязательно иммергируют.
Подсчет микроорганизмов ведут в 50—100 полях зрения микроскопа либо в 50—100 квадратах окулярной сетки, если бактерий много. При подсчете отмечают соотношение морфологических форм бактерий.
Расчет количества бактерий в 1 г почвы ведут по формуле:
Ax4x108 xD
X=------------------------
50xBxC
где X — число бактерий в 1 г почвы, А — число бактерий в 50 полях зрения микроскопа, В — площадь поля зрения микроскопа, мкм2, С—объем почвенной суспензии, мл, нанесенной на стекло, D — исходное разведение почвенной суспензии.
Площадь поля зрения микроскопа определяют по формуле. Диаметр поля зрения микроскопа вычисляют с помощью окулярного и объективного микрометров. Определив цену деления окулярного микрометра при данном увеличении микроскопа, определяют диаметр поля зрения в микрометрах и рассчитывают площадь поля зрения микроскопа (см. выше).
Пользуясь окулярным и объективным микрометрами, можно определить также площадь квадрата окулярной сетки.
Пример расчета
Если сторона квадрата окулярной сетки равна 0, 02 мм, а площадь квадрата—0, 0004 мм2 (окуляр 10Х, объектив 90Х), тогда на площадь препарата 4 см2 приходится 1000 000 таких квадратов окулярной сетки. Допустим, что на один квадрат окулярной сетки в среднем приходится 3, 5 бактерии, тогда на площади препарата 4 см2 окажется: 3, 5 х 1000000 = 3500000 бактериальных клеток. А если учесть, что на препарат наносили 0, 01 мл почвенной суспензии, в которой содержится 0, 001 г почвы (разведение 1/10), то полученную величину необходимо умножить на 1000, тогда в 1 г исследуемой почвы будет содержаться 3 500 ООО х 1000 = 3500000000 бактериальных клеток. Таким образом, каждая бактерия в квадрате окулярной сетки отвечает 1 млрд. бактерий в 1 г почвы.
|
|
|
ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ВЕЩЕСТВ
Работа 29. Аммонификация белка
Процесс разложения органических азотсодержащих веществ с выделением аммиака носит название аммонификации. Аммонификацию ведут различные микроорганизмы: бактерии, грибы, актиномицеты. Процесс идет в аэробных и анаэробных условиях.
Аммонификация белка начинается с гидролиза белка под влиянием протеолитических ферментов, выделяемых микроорганизмами, с образованием последовательно пептонов, полипептидов, дипептидов и аминокислот.
Далее аминокислоты путем дезаминирования разрушаются с образованием аммиака и разнообразных органических соединений в соответствии с характером аминокислот и окружающих условий среды. Продукты промежуточного распада аминокислот могут быть ассимилированы клетками микроорганизмов или разрушены ими дальше. Основными конечными продуктами аэробной минерализации белка являются аммиак, углекислый газ, вода, соли серной и фосфорной кислот.
В анаэробных условиях промежуточные продукты распада аминокислот полностью не минерализуются. Поэтому при разрушении белка в анаэробных условиях, помимо аммиака и углекислого газа, накапливаются различные органические соединения: органические кислоты, спирты; сероводород и его производные—меркаптаны; токсические соединения—диамины и птомаины (в частности, кадаверин, компонент трупного яда); дурно пахнущие продукты — индол и скатол. Материалы и оборудование
Весы, разновесы, колба объемом 100—150 мл, стерильная дистиллированная вода, почва, водяная баня, электроплитка, спиртовка, микробиологическая петля, пинцет, скальпель, предметные стекла, целлофан, резиновые колечки, чашки Петри, красная лакмусовая бумага, полоски фильтровальной бумаги, пропитанные 10%-ным раствором ацетата свинца, водный раствор фуксина или генцианвиолета, микроскоп, пробирки с МПБ, МПА и средой Мишустина.
|
|
|
