 |
Выделенного из сыворотки крови
|
|
|
|
Низкомолекулярные адгезивные белки
С явлением СМД мы столкнулись в 70-х годах, исследуя адгезивные белки из тканей млекопитающих [8-11]. Адгезивные белки из печени и легкого крыс оказывали мембранотропное действие в концентрациях 10 (-8) - 10(-9) мг белка/мл и оказывали влияние на клеточную адгезию при 10(-11)- 10(-12) мг белка/мл. Дальнейшие исследования показали, что обнаруженные нами адгезивные белки являются низкомолекулярными гликопротеинами, причем степень гликозилирования достигает 50-60%.По способности сохраняться в растворимом состоянии в насыщенном растворе сульфата аммония, идентифицированные адгезивные гликопротеины могут быть сопоставлены с S100 белками [12], первый представитель которых был обнаружен в 1965 г.[13].
В настоящее время S100 белки активно изучаются [14,15], однако сведения об их гликозилировании отсутствуют. Практически нет и сведений об их функции. Предполагается, чтоэта группа белков играет важную роль в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки, адгезии, миграции, апоптоза и др. Считается, что такое многообразие биологических эффектов, производимых S100 белками, обусловлено способностью этих белков регулировать концентрацию ионов кальция, функционирующих в качестве вторичных мессенждеров, за счет их связывания [15,16].
Необходимо отметить, что в литературе отсутствуют сведения и о действии S100 белков в СМД. Обнаруженные нами низкомолекулярные адгезивные гликопротеины, согласно данным рН-изоэлектрофокусирования, условно делятся на три основные группы: кислые, нейтральные и основные (рис.1). Следует отметить, что такая картина количественного распределения адгезивных белков типична для исследованных нами тканей органов: кровь, печень, легкое, сердце, тимус, мозг, сетчатка и ретинальный пигментный эпителий глаза.
|
|
|
Все адгезивные низкомолекулярные белки были исследованы с помощью оригинального метода оценки влияния на вязкоупругие свойства ткани ткани печени при деформационных воздействиях [17]. Было установлено, что все белки проявляют биологическую активность в СМД, соответствующих 10(-14)-10(-19) М р-ру.
Во всех тканях низкомолекулярные кислые и основные адгезивные белки являются доминирующими по сравнению с нейтральными. Однако, наиболее изученным нами к настоящему времени оказался белок из сыворотки крови млекопитающих с рI в области рН 4,6-4,7, относящийся к группе условно нейтральных адгезивных гликопротеинов.
Этот гликопротеин с мол. массой около 12000 Да, масса белковой части около 5500 Да, углеводной части, представленной N-олигоманнозидными цепями, - около 6500 Да, проявлял разнообразные биологические эффекты в сверхмалых дозах, а также в «мнимых» растворах (рис.2). Этот гликопротеин - ГПЯ-12 - оказывал влияние на свойства плазматической мембраны гепатоцитов (причем только в условияхсохранения гистоструктуры железы), клеточную пролиферацию, рост культуры фибробластов млекопитающих in vitro, а также проявлял ранозаживляющее, хондропротекторное и остеостимулирующее, гепатопротекторное действия [17-22].
Методом оценки влияния на вязкоупругие свойства ткани печени при деформационном воздействии было показано, что ГПЯ-12 проявляет биологическую активность в состоянии «мнимых растворов» (рис.2,3). Изучение зависимости величины биологического эффекта, производимого ГПЯ-12, от его концентрации показывает, что она имеет полимодальный характер, причем наиболее ярко выражен максимум биологической активности в области 10(-10) и 10(-14)-10(-19) М. Интересно отметить, что в состоянии «мнимых» растворов величина биологического эффекта ГПЯ-12 также всегда достоверно отличается от контрольных данных [область 10(-23)- 10(-25) М] (рис.2,3). Исследование биологического эффекта, производимого ГПЯ-12 в трех концентрациях, соответствующих 10(-9) М; 10(-19) М; 10(-29) М р-ру, показало, что во всем временном интервале опытные данные статистически достоверно отличались от контрольных (рис.3). Небольшие различия между опытными и контрольными данными в первые две часа инкубации органной культуры печени, очевидно, объясняются адаптацией ткани печени в первые часы культивирования. Обращает на себя внимание тот факт, что характер кривых, отображающих временную зависимость величины биологического эффекта ГПЯ-12, для всех исследуемых концентраций аналогичен. Эти данные позволяют высказать предположение о том, что молекулярный механизм, лежащий в основе биологического эффекта ГПЯ-12 в концентрациях 10(-9) М и 10(-19) М р-ра и в состоянии «мнимого» раствора - 10(-29) М, одинаков и, очевидно, обусловлен изменением состояния воды, вызванным воздействием гликопротеина.
|
|
|
Таким образом, в свете сформулированной нами концепции о механизме феномена СМД, можно высказать предположение о том, что роль низкомолекулярных адгезивных белков, относящихся ксемейству S100 белков, состоит в их способности влиять на воду и переводить ее в состояние, отвечающее стадии восприятия информационного сигнала.
Теплоемкость водных растворов гликопротеина,
выделенного из сыворотки крови
Первым доказательством изложенных выше положений послужили результаты исследования теплоемкости воды в присутствии ГПЯ-12. Для понимания механизма наблюдаемых биологических эффектов представлялось необходимым, первую очередь, изучить температурную зависимость теплоемкости растворов ГПЯ-12 как важнейшую термодинамическую характеристику этих растворов, которая представляет собой некоторую информацию не только о состоянии вещества в растворе, но и о изменении состояния растворителя при воздействии вещества [23].
Измерение температурных зависимостей избыточных теплоемкостей водных растворов ГПЯ-12 по отношению к воде проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (Институт биологического приборостроения РАН) в интервале температур 290-380 К при скорости сканирования температуры 2 град/мин и избыточном давлении 0,49 МПа. Шкалу теплоемкостей калибровали по эффекту Джоуля-Ленца и дополнительно проверяли, используя в качестве калориметрического стандарта водный раствор метанола. Измеренная нами парциальная молярная теплоемкость раствора метанола при 298 К составила 153,2 дж/моль К, что находится в хорошем соответствии с данными Махатадзе и Привалова - 153,3 дж/моль К [24].
|
|
|
Расчет удельных теплоемкостей (Ср) растворов ГПЯ-12 производили по формуле 1:
Vф /\ Cр Ср= Ср,I---- - -----
V1m где: Ср,I - удельная теплоемкость воды, дж/г.К;
Vф и VI - удельные объемы водных растворов ГПЯ-12 и
воды сооветственно, мл/г;
/\ Ср - измеренная экспериментально разность
теплоемкостей между водой и водным
раствором ГПЯ-12, дж/К;
m - масса ГПЯ-12 в ячейке калориметра, г.
Значения удельных теплоемкостей и объемов для воды были взяты из литературных источников [25]. Парциальный удельный объем для ГПЯ-12 расчитан, исходя из данных о его составе [18] и значений парциальных удельных объемов аминокислотных и углеводных остатков [26, 27], по аддитивной схеме и был равен 0,67 мл/г.
Было установлено, что термограммы водных растворов ГПЯ-12 не содержат эндотермических пиков, характерных при термической денатурации биополимеров, в частности, белков [28], во всем исследуемом температурном интервале, что свидетельствует, по-видимому, о развернутом состоянии молекулы ГПЯ Учитывая это обстоятельство, была вычислена удельная теплоемкость раствора ГПЯ-12 по аддитивной схеме, исходя из данных о составе ГПЯ-12 [18], с использованием данных по парциальным удельным теплоемкостям аминокислотных остатков [29] и экспериментально измеренной удельной теплоемкости гликозидной части ГПЯ-12. Это теоретически расчитанное значение составило 1,8 Дж/г К. Следовало ожидать, что экспериментально измеряемая величина удельной теплоемкости ГПЯ-12 должна быть близкой к этому значению.
Однако, расчитанное по формуле 1 значение Ср на основании экспериментально полученной величины /\ Ср для раствора ГПЯ-12 при концентрации 120 мкг/мл было равно 0,74+0,04 Дж/г К. Эта величина в 2,5 раза меньше теоретически расчетного значения. Более того, экспериментально определенное значение удельной теплоемкости ГПЯ-12 оказалось меньше Ср, определенной для компактных глобулярных белков - 1,3 Дж/г К, а также и для белков с развернутой формой молекул в растворе 1,8-2,1 Дж\г К, к которым можно отнести ГПЯ- 12 [29]. В чем кроется причина столь низкого значения удельной теплоемкости для растворов ГПЯ-12? Известно, что теплоемкость растворенного вещества в воде состоит из двух состовляющих: собственной теплоемкости вещества и теплоемкости его гидратации. Собственная теплоемкость вещества имеет положительное значение, теплоемкость гидратации неполярных групп вещества имеет также положительное значение, а гидрофобных - отрицательное. Это относится, в частности, к белкам и другим биополимерам [23, 30]. В таком случае, можно предположить, что более низкое значение экспериментального значения Ср для ГПЯ-12, по сравнению с расчетным, определяется необычно сильным влиянием гидрофильных групп молекул ГПЯ-12 на воду. Хроматографическим методом было установлено, что ГПЯ-12 в растворах присутствует преимущественно в виде молекулярных ассоциатов значительного молекулярного веса [18]. По этой причине следовало ожидать, что снижение концентрации ГПЯ-12 в растворе должно привести к диссоциации крупных межмолекулярных агрегатов ГПЯ-12 на более мелкие, к образованию значительных количеств его мономерной формы, и,
|
|
|
как следствие, - к более сильному влиянию ГПЯ-12 на состояние раствора ГПЯ-12 при концентрации 1,2 мкг/мл: она составила 3125 Дж/ г К (расчет производился по формуле 1). Это значение далеко выходит за рамки значений удельных теплоемкостей водорастворимых веществ и не может быть разумно объяснено никакими молекулярными особенностями ГПЯ-12: в литературе отсутствуют данные об отрицательных значениях удельных теплоемкостей веществ [31]. Поэтому единственно возможным объяснением полученных нами экспериментальных данных является представление об изменении структуры воды, возникшем в результате воздействия малых доз ГПЯ-12 (1,2 мкг/мл соответствует концентрации раствора 10 (-7) М).
Если отнести измеренное при концентрации раствора 1,2 мкг/мл значение Ср не к ГПЯ-12, а к воде, находящейся в ячейке калориметра, то, в таком случае, разность теплоемкостей между обычной водой и водой в растворе ГПЯ-12 будет равна 0,071 Дж/моль К (при 298 К). Полученный результат показывает, что «новое» состояние воды не особенно отличается по теплоемкости от обычной воды (75,161 Дж/моль К), а наблюдаемая разность теплоемкостей значительно меньше, чем, например, таковая при переходе «жидкая вода-лед», где различия достигают двукратной величины [25]. Наблюдаемое снижение теплоемкости воды в присутствии ГПЯ-12 по сравнению с обычной водой можно отнести к переходу ее молекул в более упорядочное состояние.
|
|
|
