 |
Влияние сверхмалых доз сывороточного гликопротеина.
|
|
|
|
Изменение характера водородных связей между молекулами воды можно наблюдать с помощью ИК-спектроскопии. В связи с этим нами измерены ИК-спектры воды, входящей в состав раствора сверхмалых концентраций ГПЯ-12, соответствующих 10(-9) - 10(-22) М раствору. Спектры измерены для образцов в виде тонкого слоя между окнами СаF на фурье-спектрометре (Nicоlet «Magna 720») в области 4000-1200 см c разрешением 2 см.
Для сравнения были изучены также ИК-спектры дважды перегнанной воды, бытовой воды, 1%-ного водного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Serva) и 40%-ного этилового спирта.
В ИК-спектре воды внутренним колебаниям мономерной молекулы воды относят интенсивную несимметричную ИК-полосу в области 3400 см (симметричное и антисимметричное валентные колебания ОН) и симметричную полосу в области 1645 см (деформационное колебание НОН) [32]. В рассматриваемой области спектра присутствует также довольно широкая полоса с максимумом около 2120 см, которая обычно интерпретируется как составной тон деформационного колебания c одним или несколькими межмолекулярными колебаниями. Широкую интенсивную полосу в спектре воды около 680 см обычно относят к»либрационной моде осцилляции мономера в поле соседних молекул; более слабую полосу 200 см соответственно относят к затрудненному трансляционному колебанию решетки «[33]. Обнаружено, что «структура воды в жидкой фазе представляет собой сетку сильно деформированных случайных водородных связей, слегка напоминающую существующую в кристалле льда. Диффузия в такой системе представляет собой не прыжковый процесс, а является скорее следствием непрерывного коллективного движения» [ 34].
На наш взгляд, более корректно интерпретировать полосу 200 см в спектре воды как полосу, связанную со скоррелированным туннелированием протона в многоминимумном потенциале. Это предположение подтверждается заметным различием нормированных полуширин полос: для внутренних колебаний величины 100% в области 3400 и 1645 см составляют соответственно 10% и 5%, в то время как для полосы 200 см эта величина составляет 60%. При n-кратном периодическом потенциале происходит n-кратное расщепление уровней основного состояния, что и объясняет наблюдаемые различия в величинах 100% [35]. Туннелирование протона, как показано в [35], затрагивает, в основном, низколежащие уровни. В случае малой ведичины барьера возмущение остальных уровней является незначительным. Этим и объясняется различие различие нормированных полуширин полос, наблюдаемых в спектре воды.
|
|
|
Обращает на себя сходство проявления туннелирования в различных системах, как в углеводородах (циклобутан, циклопентан), так и в неорганических системахнормированных полуширин полос, наблюдаемых в спектре воды. Обращает на себя внимание сходство проявления ту (К НРО и других, основное состояние которых описывается одночастичным двухминимумным потенциалом [36-38]. (К НРО и других, основное состояние которых описывается одночастичным двухминимумным потенциалом [36-38].
В спектрах всех изученных оюразцов не наблюдается различий в области колебаний воды. Для полосы в области 2120 см в ряде случаев отмечены изменения в положении максимума и В спектрах всех изученных оюразцов не наблюдается различий в области колебаний воды. Для полосы в области 2120 см в ряде случаев отмечены изменения в положении максимума и контура полосы. Поэтому основное внимание в настоящем связей. Добавление NaCI исследовании уделено изучению ИК-спектров имеющихся образцов в области Для лучшего понимания характера влияния ГПЯ-12 в сверхмалых дозах на воду как причины его
|
|
|
фармакологического действия [1] нами изучены ИК-спектры в средней области воды с добавлением ГПЯ-12, БСА, насыщающих концентраций NaCI, а также смеси вода-этанол в соотношении объемов 6:4. При добавлении NaCI к дважды перегнанной воде значение максимума 3400 см растет до 3408 см. Рост частоты на 8 см свидетельствует об усилении внутримолекулярной связи. В то же время, значение максимума полосы поглощения 2100 см уменьшается на 18 см, что позволяет предположить ослабление межмолекулярных вчистый этанол не вызывает изменений в спектре. По-видимому, это связано с тем, что в силу своего химического строения молекулы этанола не способны образовывать макроструктуры, подобные существующим в воде [HOH]n.
Влияние ГПЯ-12 на воду нельзя объяснить электростатическим воздействием, так как при добавлении NaCI в воду наблюдаются сдвиги полос в области 3400 и 1645 см, а в случае ГПЯ-12 подобных изменений в спектрах растворов ГПЯ-12 не обнаружено.
Для подтверждения высказанной гипотезы были измерены ИК-спектры поглощения в области 600-50 см образцов, помещенных в разборную кювету, состоящую из двух кремневых окон толщиной 0,2 мм, между которыми помещается полиэтиленой вкладыш толщиной 10 ммк. Спектры в этой области получены при разрешении 4 см. Измерен большой набор водных растворов ГПЯ-12 с концентрациями от 10 (-9)до 10(-22) М, причем между ними не обнаружено заметных различий. Результаты измерений представлены в таблице 2. Значение для ГПЯ-12 явялется средним из измерений 10 образцов (для каждого образца выполнено 2-3 измерения).
Оказалось, что полоса в области 200 см, характеризующая прямое проявление водородной связи в ИК-спектре воды, для раствора ГПЯ-12 в сверхмалых дозах (10(-(9) -10(-22) М) смещается по сравнению с водой (=196см для дважды перегнанной воды; =200 см в случае бытовой воды) в область более низких частот до значения =186 см, то есть в сторону значений, полученных для 40%-ного раствора этанола, у которого =176 см. Низкое значение величины у спиртового раствора объясняется отсутствием поперечных сшивок молекул воды, образованию которых препятствуют С Н -группы молекул этанола. Напротив, молекулы БСА, благодаря своей разветвленной структуре, инициируют как продольное, так и поперечное сшивание цепей молекул воды, что выражается в закономерном повышении значений до 208 см, которое наблюдается даже при 10(-5) М концентрации белка в растворе.
|
|
|
Таким образом, учитывая разность величин диэлектрических проницаемостей (~80 для воды и ~25 для этанола) можно понять наблюдаемые эффекты. На основании приведенных данных можно заключить, что спектр воды, по крайней мере, в области межмолекулярных колебаний, зависит от природы примесей. Разброс максимумов полос от 176 см (вода-этанол) до 208 см (раствор БСА) подтверждает предположение об образовании различных молекулярных структур воды в присутствии примесей.
Таким образом, в данной работе впервые продемонстрировано прямое доказательство изменения состояния воды в присутствии сверхмалых доз вещества - низкомолекулярного гликопротеина ГПЯ-12.
Лазерное светорассеяние - мощный инструмент изучения влияния
физико-химических факторов на структуру воды.
Растворы гликопротеина ГПЯ-12 были исследованы методом молекулярного флуктуационного светорассеяния [39]. Измерение флуктуаций квазиупругого светорассеяния образцов проводилось на флуктуационном спектрометре АГЛС ЭДАС-1. Регистрация рассеянного света проводилась в режиме гомодинирования (смешение пучков рассеянного на образце света от двух точек кюветы) под углом 90 при наложении на образец постоянного МП напряженностью 280А/м после предварительного освещения образца когерентным ИК-излучением с - 890 нм. Накопление значений интенсивности рассеянного света проводилось в течение 3минут с шагом интегрирования 5мс. Полученные временные ряды значений интенсивности рассеянного света подвергались преобразованию Фурье с вычислением спктральных характеристик - спектральной плотности мощности и спектральной дисперсии, в частотном диапазоне 0,35 - 5 Гц. Полученные спектральные характеристики подвергались дальнейшей обработке с вычислением их производных и интегралов.
Было показано, что повышение разведения препарата приводит к увеличению отклонения интегралов обеих характеристик (плотности спектральной мощности и спектральной дисперсии) от значений интегралов чистого растворителя (дистиллированной воды) (рис. 4,5). Зависимость эта не гладкая, а имеет 3 пиковых значения, равных или превышающих значения интегралов чистого растворителя и отстоящих друг от друга на 4 шага по разведению: 8-е, 10-е, 18-е и 26-е.
|
|
|
Производные спектров исследованных разведений по своему отчетливо разделяются на две группы (рис. 6). В первую группу входят разведения со значениями интегралов превосходящих или равных величине интегралов чистой воды: 4-е, 6-е, 8-е, 10-е, 18-е и 26-е. Они имеют высокие начальные значения производной в широкой частотной области, свидетельствующие о быстрой релаксации спектра с узкой областью низких частот. Вторая группа (12-е, 14-е, 16-е, 20-е, 22-е, 24-е и 28-е) имеют низкие значения производной с узкой начальной и широкой областью плавного падения ее величины, что свидетнльствует о большом наборе частот с мало различающимся уровнем плотности спектральной мощности. Полученные результаты свидетельствуют о том, что процедура разведения до сверхмалых концентраций вещества существенно изменяет физические характеристики растворителя, приводя к значительному изменению состояния воды при концентрациях вещества до 10(-28)М. Процедура разведения дает нелинейную зависимость характеристик состояния воды от концентрации. Характеристики второй группы разведений (12-е, 14-е, 16-е, 20-е, 22-е, 24-е, 28-е) говорят о более высоких по сравнению с первой группой растворов скорости процессов ассоциирования - диссоциирования оптических неоднородностей (водных ассоциатов) разного размера. В нашей работе [40] было показано, что процесс множественного разведения приводит к увеличению времен жизни свободных ОН-групп в воде, то есть к увеличению скоростей процессов ассоциирования - диссоциирования. Эти концентрационные области разделяются зонами концентраций (первая группа растворов) с повышенным уровнем аасоциирования. Таким образом, по мере разведения от 10(-4) до 10(-28) М наблюдается смена типа структурированности жидкой среды.
Заключение.
Данные, полученные на примере исследования физико-химических и биологических свойств ГПЯ-12- низкомолекулярного адгезивного гликопротеина из сыворотки крови, свидетельствуют в пользу сформулированной нами концепции о механизме, лежащем в основе феномена СМД. Эти результаты представляют собой не только еще одно доказательство способности биологически активных веществ производить эффекты в СМД, но и демонстрируют уникальное влияние таких веществ на состояние воды. На наш взгляд, роль низкомолекулярных адгезивных белков - структурных компонентов ММ, заключается в поддержании такого состояния воды в биологических системах, которое обеспечивает распространение в них информационного сигнала.
|
|
|
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ N96-04-48890 и N97-03777/-33025.
Список литературы
1. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Рос. хим. ж. (ЖВХО им. Д.И. Менделеева). 1997. Т.42. N3. С.85-90
2. Ямскова В.П., Ямсков И.А. Рос. хим. ж. (ЖВХО им.Д.И. Менделеева). 1999. в печати
3. Бурлакова Е.Б. Вестник Российской академии наук. 1994. Т.64. N 5. С.425-431.
4. Сазанов Л.А., Зайцев С.В. Биохимия. 1992. Т.57. вып.10. С.1443-1459.
5. Бурлакова Е.Б., Корадов А.А., Худяков И.В. Известия РАН. Сер. биол. 1990. N 2. C.184-193.
6. Блюменфельд Л.А. Биофизика. 1993. N 1. C.129-132..
7. Zaitsev S.V., Sazanov L.A. J. of Chem. and Biochem. Kinetict. 1991. V.1. N 3. P.21-26.
8. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Левенталь В.И., Ланковская Т.П., Бочарова О.К., Маленков А.Г. Биофизика. 1977. Т.22, С.168-174.
9. Маленков А.Г., Модянова Е.А., Ямскова В.П. Биофизика. 1977. Т.22, С.156-157.
10. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Резникова М.М., Маленков А.Г. Молекулярная биология. 1977. Т.11. N5. С.1147-1154.
11. Ямскова В.П., Резникова М.М. Успехи биологической химии. 1979. Т.20, С.95-112. 12. Donato R. Cell Calcium. 1986. V.7. P. 123-145.
13. Moore B.W. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. V.19. P.739-744.
14. Berchtold M. J. Mol. Evol. 1993. V. 36. P. 489-496.
15.Santella L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998.V.244. P.317-324
16.van Eldik L., Zimmer D.B. J. Dairy Sci. 1988. V.71. P. 2028-2034.
17. Ямскова В.П., Резникова М.М. Журнал общей биологии. 1984. Т.45. N3. С.373-382.
18.Ямскова В.П., Резникова М.М. Журнал общей биологии. 1991. Т.52, N2. С.181-191.
19.Буеверова Э.И., Брагина Е.В., Резникова М.М., Ямскова В.П., Хрущов Н.Г. ДАН СССР. 1985. Т.281. N1. С.158-160.
20. Ямскова В.П., Нечаева Н.В., Туманова Н.Б., Юровицкий Ю.Г., Новикова Т.Е., Фатеева В.И.,
21. Туманова Н.Б., Попова Н.В., Ямскова В.П. Известия Акад. наук. серия биол. 1996. N.6. С.653-657.
22. Гундорова Р.А., Хорошилова-Маслова И.П., Ченцова Е.В., Илатовская Л.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Вопросы офтальмологии. 1997. т.113. N2. с.12-15.
23. Makhatadze G.I., Privalov P.L. Adv. Protein Chem. 1995. V.7. P.307-417.
24. Makhatadze G.I., Privalov P.L. J. Mol. Biol. 1990 V.213. P.375-384.
25. Hodgman M.S., Weast R.W., Selby S.M.(Ed) Handbook of Chemistry and Physics. The chemical Rubber Co. Cleveland, Ohio, USA. 1955-1956. 3156P.
26. Zamyatnin A.A. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1984. V.13. P.145-163.
27. Hiland H. In: Thermodynamic data for Biochemistry and Biotechnology. Ed. Hinz H.-J., Springer-Verlag, Berlin.
P.17-45.
28. Privalov P.L. Adv. Protein Chem. 1979. V.35. P.1-104.
29. Privalov P.L., Makhatadze G.I. J. Mol. Biol. 1990. V.213. P.385-391.
30. Privalov P.L., Makhatadze G.I. J. Mol. Biol. 1992. V.224. P. 715-723.
31. Cabani S., Gianni P., Mollica V., Lepori L. J. Sol. Chem. 1981. V.10. N.8. P.563-595.
32. Юхневич Г.В. Инфракрасная спектроскопия воды. 1973. М. Наука. 209 С.
33. Roberison C.W., Curnutte B., Williams D. Molecular Physics. 1973. V.26. P.1.
34. Крокстон К. Физика жидкого состояния. Статическое введение. 1978. М., Мир, 400 С. Rahman A., Stilling F.H. J. Chem. Phys. 1971. V.55. P. 3336; 1972. V.57. P.1281.
35. Vibration spectra and Structure. v.1. Edited by James R.Durig. Marcel Dekker, Inc., New York, 1972. 196P.
36. Алексанян В.Т., Антипов Б.Г., Узерницкая М.Г. Оптика и спектроскопия. 1981. Т.50. Вып.6. С. 1113-1116.
37. Алексанян В.Т., Антипов Б.Г. Химическая физика. 1985. Т.4. N4. С.551-556.
38. Блиц Р., Жекш Б. Сегнетоэлектрики и антисегнетоэлектрики. Динамика решетки. М. Мир. С.152.
39. Черников Ф.Р., Сорокин В.Н., Оленев А.Л., Мифтахутдинов С.Г. Способ определения качества гомеопатических лекарственных средств и устройство для его реалшизации. Патент Российской Федерации RU 2112976 C1.
40. Черников Ф.Р. Биофизика. 1991. Т.36. С.741.
Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской Академии наук, 117813, ул. Вавилова 28, тел. 135-50-37 (р); тел. 422-36-37 (д)
Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля Российской Академии наук; 117977, ул. Косыгина, д.4, тел. 135-92-90 (р); тел. 147-35-70 (д)
Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова Российской академии наук, 117808, ул. Вавилова 26, тел. 135-55-07 (р); 422-36-37 (д)
Ямсков Игорь Александрович - автор для переговоров и переписки (тел.135-50-37; 422-36-37).
|
|
|
