индуцированного мутагенеза

 

Данные по химическому мутагенезу показывают, что процесс формирования мутаций многоступенчат и включает ряд стадий.

Вначале в немутантном гене в результате прямого или непрямого воздействия мутагена на ДНК возникает изменение, рассматриваемое как предмутационное (например, димер тимина и цитозина или алкилированное основание). Такое изменение может оказаться летальным или подвергнуться репарации. Это, в свою очередь, может восстановить нормальный ген либо привести к фиксации предмутационного повреждения и возникновению мутантного гена и соответственно мутантной клетки. В том случае, если клетка не гибнет, а сохраняет жизнеспособность, ее размножение ведет к образованию мутантного клона.

Тип мутаций определяет относительную специфичность этого процесса. В случае генных мутаций специфичность, как следует из приведенных в этом разделе примеров, проявляется в существовании “горячих точек” индуцированной мутабильности, характер распределения которых зависит от двух факторов - последовательности нуклеотидов в данном гене и использованного мутагена. Вырожденность генетического кода обусловливает возможность замены нуклеотидов в третьем положении кодона без замен аминокислот в полипептидной цепи. Наряду с этим появление новой аминокислоты в результате мутации может не отразиться на активности фермента. Несомненно, от особенностей реакции мутагена с теми или иными нуклеотидами или последовательностью нуклеотидов зависит, какие участки гена будут оставаться “холодными”, т.е. не претерпевать изменений, а какие - “горячими”, т.е. мутировать часто. В силу двух первых причин даже мутации в “горячих точках” могут быть “молчащими”, если они не проявляются фенотипически. С этим, в частности, связано то, что истинная частота мутаций в данном гене всегда выше частоты появления мутантов по контролируемому им признаку.

Специфичность мутагенеза в отношении типа возникающих хромосомных мутаций оценивается по частоте образования внутренних делеций, концевых нехваток, инверсий, дупликаций и транслокаций. Вместе с тем специфичность действия мутагена определяется и рядом других факторов, значимость которых зависит от типа мутагена, особенностей клеточных процессов, влияния окружающей среды. К ним относятся: влияние внехромосомных компонентов клетки (ядерной оболочки, хромосомного белка) на проникновение мутагена; локальные различия в структуре хромосом, облегчающие проникновение мутагенов к одним генам по сравнению с другими; характер репарации предмутационного повреждения, определяющий его дальнейшую судьбу; зависимость проявления мутаций от изменений структурных компонентов клетки (например, мембран или рибосом), особенностей генотипа клетки (например, наличие генов-мутаторов или антимутаторов); возможности для образования мутантного клона, в значительной степени зависимые от окружающей среды.

Проблема мутагенной специфичности лежит в основе представлений о направленном и ненаправленном мутагенезе. Стремление к индукции направленных мутаций, открывающих неограниченные возможности для переделки живой природы, определяло поиски мутагенов, способных специфично воздействовать на тот или иной ген и вызывать мутации по вызываемому признаку. Ни один из известных теперь мутагенов такой избирательной специфичностью не обладает. В какой-то мере исключение из этого общего правила составляет нитрозогуанидин, с помощью которого удается провести локализованный мутагенез у бактерий. Как отмечалось, этот мутаген вызывает у бактерий множественные мутации, возникающие преимущественно в зоне репликативной вилки. Поэтому среди обработанных нитрозогуанидином клеток можно отбирать особи, несущие мутацию в заданном районе хромосомы. Если такая мутация приводит к устойчивости к антибиотикам либо к реверсии к прототрофности, то клоны бактерий, обладающих мутантным фенотипом, легко отбирать на соответствующих селективных средах. При этом в отобранных мутантных штаммах часто обнаруживаются и дополнительные мутации в сцепленных генах.

Существенные сдвиги в решении проблемы направленного мутагенеза произошли в последние годы в связи с разработкой методов манипулирования с изолированными ДНК. Появилась возможность подвергать мутагенной обработке не весь геном in vivo, а его определенные фрагменты in vitro. Методы клонирования генов позволяют направленно получать мутации даже при использовании обычно неспецифических мутагенов, например гидроксиламина и его производных. С помощью химически синтезированных олигонуклеотидов можно конструировать мутантные гены, содержащие небольшие вставки, делеции либо желаемые замены нуклеотидов. Таким путем были получены мутантные гены, кодирующие синтез белков некоторых бактериофагов, тРНК у дрожжей и др.

Эти и другие методы создали широкие возможности для изучения различных структурных генов и регуляторных участков ДНК, исследования связи между определенной заменой аминокислот и нарушением их функции и для получения мутантных белков. Задача ближайшего будущего - использование методов направленной индукции мутаций для создания организмов с желаемыми признаками. Успех в решении этой важной в практическом отношении проблемы связан с будущим углубленным изучением генетического аппарата животных и растений на молекулярном уровне.

 

Мутагенез и репарация ДНК

 

Различают три основные возможности формирования предмутационных повреждений ДНК и возникновения мутаций. Во-первых, мутаген может включиться в ДНК вместо нормального основания. Так, 2-аминопурин, являющийся аналогом аденина, встраиваясь в ДНК, спаривается с тимином либо цитозином, что приводит к возникновению транзиций типа АТ®ГЦ и ГЦ®АТ. Во-вторых, мутаген может сам не встраиваться в ДНК, но так модифицировать основания, что в ходе последующей репликации произойдет их ошибочное спаривание. Примеры мутагенов с подобной активностью - гидроксиламин, модифицирующий цитозин, и азотистая кислота, дезаминирующая аденин и цитозин, превращающиеся соответственно в гипоксантин и урацил. Близкий механизм мутагенного действия имеют и алкилирующие агенты - этилметансульфонат и нитрозогуанидин. Основное предмутационное повреждение, вызываемое этими мутагенами,- модификация гуанина с образованием О⁶-алкилгуанина. При отсутствии репарации последний обусловливает ошибочное спаривание с тимином, в результате которого возникают транзиции ГЦ®АТ. В-третьих, мутаген может повредить одно или несколько оснований, затрудняя или делая невозможным их спаривание с обычными основаниями. Примеры таких повреждений - димеры тимина и другие УФ-фотопродукты, подавляющие нормальную репликацию ДНК, для восстановления которой требуется индукция особого типа репарации ДНК, называемой SOS-репарацией. Именно этот тип репарации наиболее тесно связан с возникновением мутаций.

Большинство индуцированных физическими и химическими факторами повреждений ДНК, потенциально являющихся источниками мутаций, исправляются с помощью нескольких механизмов репарации, направленных на восстановление целостности структуры ДНК и тем самым на сохранение стабильности генетического материала в ряду поколений.

Все известные в настоящее время способы репарации ДНК обеспечиваются конститутивными, т.е. постоянно действующими, либо индуцированными ферментами, удаляющими повреждения, возникшие в одной из цепей ДНК. При этом некоторые способы могут не вполне точно восстанавливать исходную последовательность оснований в ДНК, вследствие чего возникают мутации.

Наиболее подробно исследована репарация ДНК в УФ-облученных клетках, поэтому большинство рассматриваемых ниже факторов относятся к репарации повреждений, индуцированных УФ-лучами.

Возможность репарации ДНК была обнаружена в 1949 г., когда три автора - А. Кельнер, Р. Дюльбекко и И.Ф. Ковалев независимо установили, что освещение видимым светом (с длиной волны свыше 400 нм) актиномицетов, бактериофага и парамеций восстанавливает их жизнеспособность после УФ-облучения в летальных дозах. Это явление названо фотореактивацией. В 1964 г. Р. Сетлоу и У. Керриер, Р. Бойс и П. Говард-Фландерс также независимо друг от друга обнаружили процесс темновой репарации ДНК, т.е. возможность удаления летальных УФ-повреждений в отсутствие обработки клеток после УФ-облучения видимым светом. Феномен обратимости повреждений, вызванных ионизирующим облучением, в клетках дрожжей и растений, впервые обнаружили в конце 50-х годов В.И. Корогодин и Н.В. Лучник. Основные механизмы репарации ДНК и ферменты, обеспечивающие этот процесс, были раскрыты к концу 70-х годов. В это же время исследования репарации ДНК стали широко проводиться на млекопитающих, хотя основным объектом для выяснения ее механизмов остаются микроорганизмы. Применение в самое последнее время различных методов работы с рекомбинантными ДНК и техники определения нуклеотидных последовательностей (секвенирования) ДНК существенно расширили возможности изучения молекулярных механизмов ее репарации. У E. coli, а затем и у дрожжей Sacharomyces cerevisiae, были клонированы и секвенированы многие гены, отвечающие за репарацию ДНК. У E. coli идентифицировано свыше 50 таких генов. Большинство генов, вовлеченных в репарацию ДНК у E. coli, обнаружены и у другой энтеробактерии - Salmonella typhimurium. У S. cerevisiae описано несколько десятков мутаций в генах, контролирующих чувствительность клеток к излучениям и химическим мутагенам.

Различают три основных типа репарации ДНК. Первый - дорепликативная репарация, называемая также внерепликативной, включает фотореактивацию и различные формы темновой эксцизионной репарации, направленной на вырезание (эксцизию) участков ДНК, несущих повреждения. Второй - пострепликативная, или внутрирепликативная, репарация - осуществляется с помощью механизмов, участвующих в процессах рекомбинации и репликации ДНК, и обеспечивает восстановление интактности ДНК, содержащей небольшое число повреждений, не удаленных в ходе репарации первого типа. Оба типа репарации ДНК устраняют основную часть предмутационных повреждений. Напротив, третий тип - индуцируемая репарация ДНК, зависимая у бактерий от функционирования генов recA и lexA, - является основным источником ошибок, приводящих к возникновению мутаций. Этот тип репарации относят к группе так называемых SOS-ответов клетки, индуцируемых повреждениями ее ДНК. Существование различных форм репарации повреждений ДНК доказано в отношении как про-, так и эукариот, однако наиболее детально эти процессы изучены у E. coli.

 

Дорепликативная репарация

 

Наибольшее количество летальных для клетки повреждений ДНК устраняется до ее репликации с помощью нескольких процессов, которые могут идти одноэтапно или многоэтапно. Примеры одноэтапного процесса, осуществляющегося с помощью одного фермента: 1) фотореактивация; 2) обнаруженное в клетках млекопитающих прямое встраивание пуринов в апуриновые сайты ДНК с помощью особого фермента, называемого пурин-инсертазой; 3) репарация после действия простых алкилирующих агентов путем отщепления алкильных групп от О⁶-метил- и О⁶-алкилгуанина, являющаяся одним из звеньев адаптивного ответа клетки на действие сверхмалых доз указанных агентов; 4) воссоединение однонитевых разрывов ДНК при 3¢-ОН и 5¢-РО₄ концевых разрывах, разделенных лишь одним нуклеотидом. Эту реакцию катализирует ДНК-лигаза. К многоэтапным процессам дорепликативной репарации относят два типа темновой эксцизионной репарации. Один из них удаляет основание, другой - нуклеотиды. К многоэтапным процессам дорепликативной репарации ДНК относится уже упоминавшаяся репарация одно- и двухцепочечных разрывов, индуцированных ионизирующей радиации (рентгеновскими и g-лучами), а также репарация ДНК, содержащей поперечные сшивки, обусловленные действием таких соединений, как митомицин С или псорален.

 

Фотореактивация

Фотореактивирующее действие видимого света связано с активностью фермента дезоксириботидпиримидинфотолиазы, специфично связывающейся с УФ-облученной ДНК и расщепляющей на мономеры основные УФ-фотопродукты - димеры двух соседних пиримидинов в одной цепи ДНК, объединенных циклобутановым кольцом. Фермент присоединяется к пиримидиновым димерам в ДНК в темноте, но реакция расщепления связей, объединяющих две молекулы пиримидина, энергетически зависима от видимого света. Особенно эффективен свет, лежащий в голубой части спектра. Подсчитано, что за 1 мин молекула фотолиазы может расщепить 2,4 димера. Фотолиазы, различающиеся по своим размерам (М_r 35 000-50 000), обнаружены у E. coli, некоторых дрожжей, в лимфоцитах человека. Все они относятся к ферментам типа флавопротеинов. В облученных клетках E. coli фотореактивация удаляет до 90% пиримидиновых димеров, что повышает выживаемость клеток и значительно снижает частоту мутаций. Однако есть данные о том, что эффективность удаления предмутационных повреждений в ходе фотореактивации зависит от типа повреждения. Так, при исследовании УФ-индуцированных мутаций в контролирующем образование аденина гене ad-3 у дрожжей и в rII области фага Т4 было показано, что фотореактивация не снижает числа мутаций с заменой оснований или со сдвигом рамки. Это свидетельствует о том, что димеры тимина не единственные факторы УФ-мутабильности и что в образовании УФ-индуцированных мутаций участвуют и другие фотопродукты. Подтверждением тому служат данные, показывающие, что (6-4) УФ-фотопродукты цитозина фотореактивации не подвергаются.

Темновая эксцизионная репарация

 

В отличие от фотореактивации другие пути репарации повреждений ДНК не нуждаются в энергии видимого света и поэтому относятся к темновой репарации.

Гипотеза о существовании темновой репарации повреждений, индуцированных УФ-лучами, была высказана в 1961 г. Э. Виткин и М. Либ на основе анализа двух взаимосвязанных явлений, обнаруженных при изучении мутагенеза у бактерий: фиксации мутаций и снижения частоты мутаций. Оба они касаются фактов замедленного проявления мутагенного действия УФ-лучей. Эта особенность наблюдалась еще в 30-х годах Л. Стадлером при анализе спектра индуцированных УФ-лучами генетических изменений у растений. Л. Стадлер построил модель действия УФ-лучей, в соответствии с которой повреждения хромосомы в виде ее разрыва или мутации - не одномоментный акт, а растянутый во времени процесс, в ходе которого фиксируются потенциальные мутационные повреждения. Такое отсроченное возникновение мутаций у бактерий выражено еще сильнее, чем у растений. Замедленный мутационный ответ характерен и для химического мутагенеза, особенно для действия алкилирующих агентов.

Анализ природы замедленных мутаций, индуцированных у E. coli УФ-лучами, проведенный Э. Виткин (1956) и Ч. Дадней с Ф. Хаасом (1958), показал, что реализация предмутационных повреждений или же их утрата зависят от того, на какой среде (обогащенной или бедной, лишенной необходимых для роста аминокислот) будут выращиваться бактерии в течение первых 1-1,5 ч после облучения. Оказалось, что инкубация облученных клеток в обогащенной среде обеспечивала высокую частоту мутаций независимо от того, в какой среде (богатой или бедной) велась последующая инкубация. Напротив, если вначале облученные бактерии 1-1,5 ч выдерживали в бедной (минимальной) среде, частота мутаций была низкой независимо от условий дальнейшей инкубации. Процесс постепенной утраты потенциальных мутаций из-за дефицита аминокислот в бедной среде был назван снижением частоты мутаций.

Восстановление нормальной структуры ДНК, содержащей не свойственные ей или модифицированные основания, обеспечивается эксцизионной репарацией. Процесс начинается с действия ферментов ДНК-гликозилаз, катализирующих гидролиз N-гликозидных связей между азотистым основанием и дезоксирибозой. ДНК-гликозилазы эффективно удаляют поврежденные либо не свойственные ДНК основания, появившиеся в ней спонтанно либо под действием УФ-, рентгеновских лучей, разнообразных алкилирующих агентов. В зависимости от типа оснований, в отношении которых проявляется активность этих ферментов, различают урацил-, гипоксантин-, 3-метиладенин-, 7-метилгуанин- и другие ДНК-гликозилазы. В результате удаления не свойственных ДНК (например, урацила) или модифицированных (например, гипоксантина, 3-метиладенина и др.) оснований, осуществляющегося без разрыва сахарофосфатного каркаса ДНК, образуются апуриновые или апиримидиновые сайты (АП-сайты), служащие, в свою очередь, субстратом действия еще одной группы ферментов, называемых АП-эндонуклеазами. Сочетанное действие ДНК-гликозилазы и АП-эндонуклеазы приводит к вырезанию АП-сайтов в составе олигонуклеотидов. На первом этапе в результате спонтанной потери оснований либо под действием ДНК-гликозилазы в полинуклеотидной цепи появляется АП-сайт. Далее этот сайт атакуется 3¢-АП-эндонуклеазой, вызывающей гидролиз фосфодиэфирных связей на 5¢-конце к АП-сайту, в результате чего освобождается 3¢-ОН конец. На следующем этапе олигонуклеотид, содержащий дезоксирибозофосфатный остаток, вырезается ферментом 5¢-АП-эндонуклеазой. Наконец, на последнем этапе образовавшаяся брешь закрывается в ходе репаративного синтеза, осуществляемого ДНК-полимеразой I, а ковалентные связи полинуклеотидной цепи восстанавливаются ДНК-лигазой.

Помимо оснований эксцизионная репарация удаляет и нуклеотиды. Этим механизмом из ДНК вырезаются индуцированные УФ-лучами пиримидиновые димеры. Следует отметить, что длительное время основным способом такой репарации считали выщепление димеров в результате совместного действия эндонуклеаз, осуществляющих одноцепочечный надрез (инцизию) вблизи димера, и экзонуклеаз, вырезающих более или менее протяженный участок цепи, содержащий димер. Последующее восстановление интактности молекулы ДНК достигается путем закрывания бреши в ходе репаративного синтеза недостающего участка цепи с помощью ДНК-полимеразы I, использующей противоположную цепь как матрицу. Эта классическая схема в недавнее время пересмотрена. При исследованиях этапа инцизии, проведенных на бактериях Micrococcus luteus, было обнаружено, что ответственный за этот этап фермент УФ-эндонуклеаза обладает двумя видами активности. Первая из них, ДНК-гликозилазная, специфичная в отношении пиримидиновых димеров (ПД-ДНК-гликозилаза), расщепляет N-гликозильную связь между 5¢-пиримидином димера и соседним основанием. Вторая, АП-эндонуклеазная, разрывает сахарофосфатный каркас. Подобная бифункциональность присуща и УФ-эндонуклеазе, кодируемой геном den V фага Т4.

В клетках Е.coli выщепление пиримидиновых димеров контролируется тремя генами uvr (от англ. ultraviolet radiation) - А, В и С, кодирующими три связывающихся с ДНК белка, которые только совместно обладают активностью УФ-эндонуклеазы. Фермент, называемый эксцизионной нуклеазой UVRABC, надрезает ДНК вблизи димера, содержащего тимин. Один надрез находится на расстоянии 7 нуклеотидов от 3¢-конца, другой - 5-6 нуклеотидов от 5¢-конца. В результате нуклеаза UVRABC удаляет из поврежденной ДНК 12-13 нуклеотидов вместе с пиримидиновым димером. Образовавшийся пробел в ходе репаративного ресинтеза заполняется ДНК-полимеразой, а целостность сахарофосфатного каркаса ДНК восстанавливается ДНК-лигазой. Подобный мультиферментный комплекс выявлен и у других бактерий, а также у дрожжей. Наряду с вырезанием тиминовых димеров нуклеаза UVRABC, ДНК-гликолиазы и др. ферменты с эндонуклеотической активностью принимают участие в репарации ДНК.

Действие эксцизионной репарации проявляется и в отношении ДНК с АП-сайтами. Такие сайты образуются спонтанно в случае тепловых флуктуаций в молекуле ДНК, приводящих к потере модифицированных оснований; при действии ионизирующей радиации и алкилирующих агентов; при репарации ДНК с участием ДНК-гликозилаз. В отсутствие репарации накопление в ДНК АП-сайтов может привести клетку к гибели, т.к. они не обладают кодирующими свойствами и препятствуют в основном безошибочной репликации ДНК. Показано, что число ошибок, возникающих при синтезе новой цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы I на матрице ДНК, содержащей АП-сайты, увеличивается в 3-6 раз.

Известны два пути эксцизионной репарации: короткими участками и длинными участками. Первый из них более эффективный и быстрый. У E. coli основной фермент, ведущий репаративный синтез ДНК короткими участками, - ДНК-полимераза I. С помощью этого типа ресинтеза репарируется до 99% пробелов, возникающих в результате вырезания участка, содержащего повреждения. Величина ресинтезированного фрагмента составляет 13-24 нуклеотида, что близко к размеру олигонуклеотида, удаляемого нуклеазой UVRABC. Присущая ДНК-полимеразе I, помимо полимеразной, 5¢-3¢-экзонуклеазная активность не участвует в самом выщеплении фрагмента ДНК, несущего повреждения, как это предполагалось ранее, а обеспечивает формирование разрывов в ДНК, представляющих собой субстраты для последующего действия ДНК-лигазы, сшивающей сахарофосфатный каркас на завершающем этапе репарации.

ДНК-полимераза I - полифункциональный фермент. Мутации в гене polA, кодирующем ДНК-полимеразу I у E. coli, значительно увеличивают чувствительность клеток к летальному действию УФ-лучей, ионизирующей радиации, алкилирующих агентов.

У E. coli помимо ДНК-полимеразы I в репаративном синтезе ДНК участвуют ДНК-полимеразы II и III. Установлено, что ДНК-полимераза II участвует в репаративном синтезе длинными фрагментами при эксцизионной репарации и в пострепликативной репарации ДНК в УФ-облученных клетках. В основном же репаративный синтез длинными фрагментами длиной 1000-1500 нуклеотидов в УФ-облученных клетках E. coli ведет ДНК-полимераза III. Этот путь обеспечивает репарацию около 1% пробелов, возникающих в ходе эксцизионной репарации. Помимо ДНК-полимеразы III еще несколько ферментов одновременно участвует в репарации и вегетативной репликации ДНК. К ним, в частности, относятся праймаза, обеспечивающая синтез РНК-затравки, необходимой для инициации репликации ДНК и синтеза фрагментов Оказаки, белки, участвующие в расплетении двухцепочечной ДНК (ДНК-хеликазы, белок SSB, ДНК-гираза и некоторые другие).

Способность эксцизионной репарации обнаружена не только у бактерий, но и у двухцепочечных фагов. Известна она и у эукариот. У млекопитающих показателем эксцизионной репарации служит “внеплановый” синтез ДНК вне периода S клеточного цикла во время нормальной полуконсервативной репликации хромосомы. Способность к репарации ДНК нарушена у лиц с наследственным заболеванием - пигментной ксеродермой - болезнью, при которой солнечное облучение приводит к развитию злокачественной опухоли кожи. Установлено, что у некоторых из этих больных подавлена активность УФ-эндонуклеазы, у других - ДНК-полимеразы I. Клетки больных первого типа, культивируемые in vitro, не способны к удалению димеров из ДНК, а клетки больных второго типа не могут репарировать ДНК, содержащую одноцепочечные разрывы.

В процессе эксцизионной репарации устраняется основная доля предмутационных повреждений ДНК, индуцированных УФ-лучами, поскольку субстратом ее действия служат не только циклобутановые димеры тимина, но и (6-4) УФ-фотопродукты цитозина. Последующий репаративный ресинтез ДНК обычно безошибочен и ведет к восстановлению исходной последовательности ДНК. Восстановление нормальной структуры ДНК, содержащей сравнительно небольшое число димеров, оставшихся в ней после того, как исчерпались возможности фотореактивации и эксцизионной репарации, осуществляется в ходе пострепликативной репарации.

 

Пострепликативная репарация (ПРР)

 

Этот способ восстановления целостности ДНК заключается в репарации пробелов, образующихся в дочерних цепях напротив не удаленных в ходе репликации димеров. Основная часть таких пробелов репарируется путем рекомбинационных обменов между двумя сестринскими дуплексами. При этом до 50% УФ-индуцированных димеров переносятся из родительской ДНК в дочернюю. В клетках E. coli процесс ПРР контролируется, по крайней мере, 17 генами.

Известны два пути рекомбинационной репарации пострепликативных пробелов в ДНК, совпадающих с путями, осуществляющими у E. coli рекомбинацию между ДНК донора и реципиента при конъюгации, трансформации и трансдукции. Основным является путь RecBC, запасным - путь RecF. Оба они контролируются геном recA. Пробелы в дочерних цепях заполняются в результате рекомбинации, а пробелы в родительских цепях - путем репаративного синтеза, осуществляемого ДНК-полимеразами I либо III. В отсутствие их обеих ресинтез идет под действием ДНК-полимеразы II. Другой путь ПРР использует механизм реципрокной рекомбинации, в результате которой димер оказывается в дочернем дуплексе, а пробел напротив него - в родительском. Этот путь включает: 1) образование двунитевых разрывов вследствие случайных разрывов рядом с димерами в родительских цепях; 2) реципрокные рекомбинационные обмены между двумя сестринскими дуплексами в гомологических областях; 3) завершение рекомбинации с образованием ДНК, свободной от повреждений.

Оба типа рекомбинационной репарации ДНК осуществляются ферментами, действующими конститутивно, и в зависимости от вида бактерий репарируют от 30 до 100% пострепликативных пробелов.

 

Индуцируемая репарация

 

SOS-репарация. М. Радман (1974) и Э. Виткин (1975) первыми указали на возможную взаимосвязь нескольких феноменов, наблюдаемых в УФ-облученных клетках E. coli. К ним относятся: 1) индукция профага l - процесс, требующий инактивации репрессора; 2) феномен W-реактивации, открытый Дж. Вейглем (1953) и выражающийся в повышении выживаемости и мутабильности УФ-облученного фага l при заражении им предварительно облученных клеток E. coli по сравнению с выживаемостью фага в необлученных клетках; 3) образование длинных нитей (филаментов) неразделившихся бактерий вследствие блокирования нормального процесса клеточного деления в облученных клетках; 4) выключение клеточного дыхания; 5) индукция мутагенеза, и ряд других.

Способность клетки реагировать на повреждения ДНК или прекращение ее синтеза путем активации группы генов, контролирующих перечисленные выше феномены, получила название SOS-ответа. Одна из форм SOS-ответа - SOS-репарация ДНК. Помимо УФ-облучения сигналами на включение SOS-репарации могут служить и другие воздействия, повреждающие ДНК.

В случае УФ-облучения индукция SOS-репарации у E. coli происходит тогда, когда в геноме находится не менее 30-60 невырезанных димеров. Возникающая задержка репликации, по-видимому, активирует группу генов, продукты которых обеспечивают SOS-репарацию ДНК. Ее характерная черта - неточность восстановления первичной структуры ДНК, поэтому такой тип репарации называют “склонной к ошибкам” в отличие от относительно безошибочной эксцизионной репарации.

По мнению ряда исследователей, в основе SOS-репарации лежит индукция новой или модификация одной из предсуществующих ДНК-полимераз, обеспечивающих возможность “трансдимерного” синтеза ДНК, в результате которого напротив димера будет находиться не брешь, а какой-то нуклеотид. Такая произвольная подстановка нуклеотида во вновь образующуюся нить может привести к мутации. Прямые доказательства этой гипотезы отсутствуют, однако существование мутагенной репарации выявлено у фага Т4 и грибов, различных видов дрожжей, у D. melanogaster. Обнаружена она и у млекопитающих, для которых установлено, что пострепликативные бреши действительно могут заполняться за счет синтеза ДНК, а не в результате рекомбинации. Примечательно, что в отличие от конститутивной безошибочной эксцизионной репарации SOS-репарация сопряжена с синтезом белка de novo и происходит в богатой питательной среде. Это соответствует условиям, ведущим к фиксации мутаций в УФ-облученных клетках E. coli.

Общее свойство всех SOS-ответов у E. coli - их абсолютная зависимость от активности генов recA и lexA. Первый из них кодирует синтез белка-индуктора SOS-системы, второй - белка-репрессора гена recA и ряда других генов, кодирующих SOS-функции. Продукт гена recA - RecA-белок- полипептид (М_r 37 842), обладающий несколькими формами ферментативной активности. Главная для регуляции SOS-ответа - протеолитическая: RecA расщепляет или стимулирует аутопереваривание белка LexA и репрессоров генов ряда SOS-функций, например репрессора фага l, поддерживающего его в состоянии профага. Помимо протеазной активности RecA-белок обладает еще и АТФ-азной и хеликазной формами активности, важными для его участия в процессах рекомбинации и рекомбинационной ПРР ДНК. При отсутствии индуцирующих воздействий исходный сравнительно низкий уровень белка RecA в клетках E. coli составляет 800-1200 молекул на клетку. Однако в условиях индукции SOS-системы синтез белка RecA резко усиливается и может достигнуть 30% от общего содержания белка в клетке. Другой важнейший для функционирования SOS-системы ген - lexA, - кодирует белок с М_r 22 700.

Ключевую роль в регуляции SOS-системы играет взаимодействие белков RecA и LexA. В интактной клетке исходный уровень белка RecA обеспечивает рекомбинацию, но его недостаточно для индукции SOS-функций. В неповрежденной клетке возможность избыточной продукции белка RecA подавлена (репрессирована) белком LexA. Повреждения ДНК активируют RecA-протеазу, переваривающую LexA-репрессор. Это, в свою очередь, приводит к индукции других генов SOS-системы, репрессоры которых также расщепляются белком RecA. По мере того как количество молекул RecA-протеазы исчерпывается, вновь синтезируется интактный LexA-репрессор и вся SOS-система выключается. Из этой модели следует, что SOS-система является саморегулирующейся, причем белок RecA ее позитивный, а белок LexA - негативный регулятор. Таким образом, SOS-ответ клетки складывается из следующих этапов: индуцирующий сигнал, синтез RecA-белка и его активация, разрушение репрессоров и индукция SOS-функций.

По мере репарации ДНК факторы, индуцирующие SOS-ответ, элиминируются и в течение 30-60 мин после индуцирующего воздействия RecA-протеаза инактивируется. Синтез белка LexA, однако, продолжается и, так как теперь ничто не мешает его функционированию, происходит репрессия генов SOS-системы. Клетка возвращается в неиндуцированное состояние.

Из почти 20 генов, контролирующих SOS-функции клетки у E. coli, для мутагенеза существенны лишь гены recA, lexA и состоящий из двух генов оперон umuDC. Мутации в любом из генов этого оперона подавляют мутагенез, индуцированный УФ-лучами, метилметансульфонатом и другими видами воздействия. В случае повреждения ДНК RecA-протеаза расщепляет репрессор оперона umuDC и последний начинает функционировать. Предполагается, что продукты, кодируемые генами umuDC, каким-то образом модифицируют клеточные ДНК-полимеразы, в результате чего они осуществляют синтез ДНК в обход димеров пиримидина.

Адаптивный ответ. Помимо SOS-репарации в клетках E. coli действует еще один путь индуцируемой репарации ДНК, называемый адаптивным ответом на действие алкилирующих агентов. В отличие от SOS-репарации адаптивный ответ recA - независим. Адаптивный ответ наблюдается в случае, если клетки до обработки основной, большой, дозой алкилирующих агентов (например, нитрозогуанидина либо N-метил-N-нитрозомочевины) подвергаются воздействию очень низких, нелетальных доз тех же соединений. Предобработка бактерий низкими дозами алкилирующих агентов обусловливает индукцию ферментов репарации, специфично действующих на алкилирование ДНК. Один из этих ферментов - индуцируемая О⁶-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза - переносит метильную группу с О⁶-метилгуанина (основного предмутационного повреждения в алкилированной ДНК) на остаток цистеина, входящий в состав самого фермента, и тем самым непосредственно исправляет повреждение ДНК. Другой фермент - индуцируемая ДНК-гликозилаза - удаляет ряд потенциально летальных повреждений в ДНК, включая 3-метиладенин, 3-метилгуанин и др.

Системы индуцируемой репарации ДНК действуют не только у прокариот, но и эукариот. Так, гены, функционально близкие к генам, контролирующим SOS-функции у E. coli, обнаружены у дрожжей. Индукция ферментов, приводящих к снижению мутагенного эффекта и увеличению выживаемости в случае предобработки малыми дозами алкилирующих агентов, описана у крыс. У млекопитающих известны и другие индуцируемые ферменты, связанные с повреждениями ДНК. Однако обнаружить индуцируемую систему репарации ДНК, приводящей к увеличению клеточного мутагенеза у млекопитающих, пока не удалось.

 

Спонтанный мутагенез

 

О существовании спонтанных мутаций было известно задолго до того, как был открыт индуцированный мутагенез, однако природа индуцированных мутаций известна намного лучше.

Первые попытки объяснить причины спонтанных мутаций основывались на данных, полученных при анализе радиационного мутагенеза. Поскольку существуют космические лучи и естественный фон радиоактивности, а кривые “доза-эффект” для ионизирующего излучения характеризуются отсутствием порога, то спонтанное мутирование генов, по крайней мере, отчасти, должно быть связано с действием этих факторов.

Подсчитано, что у дрозофилы естественный радиационный фон ответствен лишь за 0,1% спонтанных мутаций. Однако с увеличением продолжительности жизни организма эффект естественной радиации увеличивается. У человека его доля в общем объеме спонтанных мутаций может достигать 25%. Значительная часть мутаций у одноклеточных организмов и вирусов, классифицируемых как спонтанные, на самом деле вызвана естественным радиационным и УФ-облучением.

Усиливает образование спонтанных мутаций и повышение температуры окружающей среды. Каждые 10°С повышения температуры могут увеличить частоту мутаций до пяти раз.

В основном же возникновение спонтанных мутаций связано не с внешними воздействиями на организм, а со случайными повреждениями генов и хромосом в процессе нормального клеточного метаболизма. Физиологическое состояние клеток также существенно влияет на спонтанный мутагенез. Повышение частоты естественных мутаций по мере увеличения возраста клеток было отмечено еще в 1933 г. М.С. Навашиным на семенах растений Crepis capillaris. К эндогенным факторам спонтанного мутагенеза относятся: 1) ошибки в ходе репликации ДНК; 2) ошибки репарации; 3) ошибки рекомбинации ДНК; 4) действие генов мутаторов и антимутаторов; 6) действие других факторов эндогенного происхождения.

 

Связь спонтанного мутагенеза

с репликацией, репарацией и рекомбинацией ДНК

 

На возможную связь возникновения спонтанных мутаций с процессами репликации ДНК первыми указали Уотсон и Крик на основе представлений о таутомерных превращениях внутри молекулы ДНК. В результате редко возникающих перемещений атомов водорода из одних положений в пурине или пиримидине в другие, более стабильные, кетоформы тимина и гуанина и аминоформы аденина и цитозина подвергаются таутомеризации, превращаясь в менее стабильные энольную и иминоформы соответственно. Следствием таких переходов может быть образование АЦ- и ГТ-пар, ведущее к появлению спонтанных транзиций и трансверсий. Установлено, однако, что основной вклад репликации ДНК в возникновение спонтанных мутаций связан с ошибками в работе ДНК-полимераз и химической модификацией цитозина.

Подсчитано, что ошибки в ходе полимеризации ДНК возникают с частотой примерно 10^-5. Корректорная 3¢-5¢-экзонуклеазная активность ДНК-полимераз снижает эту частоту до 10^-10 в расчете на включающийся нуклеотид. Репаративные процессы еще более уменьшают возможность возникновения подобных ошибок. Тем не менее, число их все же достаточно для возникновения генетически наследуемых изменений в данном гене, регистрируемых как спонтанные мутации. Связь спонтанного мутагенеза с функционированием ДНК-полимераз подтверждается данными о мутаторной активности мутантов E. coli с дефектной ДНК-полимеразой III. “

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: