1.3.2. Обнаружение репликации вируса бешенства после инокуляции

Эти тесты обнаруживают инфекционность тканевой суспензии в клеточных культурах или в лабораторных животных. Их следует использовать, если реакция флуоресцирующих антител даёт неопределённый результат или если реакция флуоресцирующих антител даёт отрицательный результат в случае известного заражения людей. Там, где возможно, выделение вируса на клеточной культуре должно считаться предпочтительнее тестирования путем заражения мышей. Тесты, проводимые на культуре клеток, такие же чувствительные, как и тесты путем заражения мышей (Rudd & Trimarchi, 1989), но менее дорогие, дают более быстрые результаты и в них не используются животные.

i) Тестирование путём культивирования клеток

Клетки нейробластомы, например, N2a CCL-131 в Коллекции культур американского типа (АТСС)1, являются высоко восприимчивыми к инфицированию лиссавирусами. Клетки выращивают в модифицированной Дульбекко среде Игла с 5% фетальной телячьей сывороткой (ФТС), инкубируют при 360С с 5% СО2. Клеток почки хомячка (ВНК-21) также чувствительны к большинству уличных изолятов без какого-либо адаптационного этапа, но перед использованием их необходимо проверять на восприимчивость к вариантам вируса, преобладающим в определенном регионе. Тестирование путем культивирования клеток можно проводить с использованием многолуночных пластмассовых планшетов, многокамерных стеклянных слайдов и стеклянного покровного стекла. Чувствительность, аналогичная тестам путем заражения мышей для обнаружения штаммов бешенства (Rudd & Trimarchi, 1989), была продемонстрирована при использовании одного четырехдневного пассажа в 96-луночном планшете. Однако считается, что дополнительные пассажи могут увеличить чувствительность. Цитотоксичность является подтвержденным фактором, влияющим на надежность результатов тестирования. Методы, применяющиеся для снижения цитотоксичности, включают добавление антибиотиков, сокращение времени до смены среды (до 35 минут) и разведение образцов. Тестирование путём культивирования клеток и их варианты должны быть полностью валидированы до использования.

1 Коллекции культур американского типа (АТСС), P. O. Box 1549, Manassas, Virginia 20108, Соединенные Штаты Америки

Предлагаемый протокол для 96-луночного планшета: К 200 мкл свежеприготовленного в четырех лунках 96-луночного планшета из суб-конфлуэнтной плашки 2х105 клеток/мл суспензии добавляют 100 мкл очищенного гомогената мозга (20% в фосфатно-буферном растворе, 0, 1 М, рН 7, 4). Через 24 часа инкубации при 5% СО2 и температуре 37°С супернатант удаляют из каждой лунки и в каждую лунку добавляют 200 мкл свежей среды. Через следующие 72 часа инкубации супернатант удаляют пипеткой и хранят. Клетки фиксируют в 80% ацетоне и окрашивают флуоресцирующими антителами в соответствии с рекомендациями производителя. Варианты включают сокращение времени инкубации до смены среды для уменьшения токсичности клеток, использование агентов клеточной проницаемости (например, DEAE-dextran) и дальнейшие

пассажи. Считается, что чувствительность может быть увеличена тремя пассажами.

Предлагаемый протокол для использования в 8-камерных слайдах Lab-Tek ®: К 400 мкл свежеприготовленного из суб-конфлуэнтной плашки 105 клеток/мл суспензии добавляют 50 мкл очищенного гомогената мозга (20% в измельчающем субстрате, приготовленном из фосфатно-буферного раствора, 0, 1 М, рН 7, 4 термоактивированной сывороткой новорожденного теленка). Через 24 часа инкубации при 5% СО2 и температуре 35, 5°С супернатант удаляют из каждой лунки и в каждую лунку добавляют 400 мкл свежей среды. Через следующие 24 часа инкубации (или более) удаляют супернатант, структуру камеры, клеточный слой высушивают и фиксируют чистым высококачественным холодным ацетоном. Затем клеточный слой окрашивают флуоресцирующими антителами в соответствии с лабораторными процедурами. Варианты включают время инкубации, использование агентов клеточной проницаемости (например, DEAE-dextran) и дальнейшие пассажи. Удаленные супернатанты должны храниться для последующих пассажей.

i) Тестирование путём заражения мышей

От трех до десяти мышат в возрасте 3-4 недель (12-14 г) или помёт 2-дневных новорожденных мышат прививают интрацеребральным способом. Посевной материал представляет из себя осветлённую надосадочную жидкость 10-20% (в/о) гомогената материала головного мозга включая мозговой ствол (кора головного мозга, аммонов рог, мозжечок, продолговатый мозг) в изотоническом буферном растворе, содержащем антибиотики. При проведении прививки мышам следует давать наркоз. За мышами проводят ежедневное наблюдение в течение 28 дней, а каждую погибшую мышь исследуют с помощью реакции флуоресцирующих антител на наличие бешенства. Для получения более быстрых результатов на новорожденных мышатах можно тестировать одного мышонка с помощью реакции флуоресцирующих антител на 5, 7, 9 и 11ый день после инокуляции. Все случаи гибели в течение первых 4х дней считаются неспецифическими (из-за стрессовой/бактериальной инфекции и т. д. ).

Если в лаборатории есть подразделение для проведения тестирования путем культивирования клеток, то, там, где возможно, необходимо заменить тест путем

заражения мышей на тест путем культивирования клеток, так он не предполагает использование живых животных, является менее дорогостоящим и дает более быстрые результаты. Однако, преимущество теста путем заражения мышей состоит в том, что когда результаты теста положительные, то с целью идентификации штамма большое количество вируса можно изолировать из одного мышиного мозга. Кроме того, он может быть использован в ситуациях, когда опыта и оборудования для проведения других тестов (например, культивирования клеток) недостаточно. Используя тест путем заражения мышей помимо вируса бешенства можно обнаружить другие вирусы.