 |
1.3.3. Методы молекулярной диагностики
|
|
|
|
1. 3. 3. Методы молекулярной диагностики
Различные молекулярные диагностические тесты, например, обнаружение вирусной РНК посредством ПЦР с обратной транскрипцией (РТ-ПЦР), ПЦР-ИФА, гибридизации in situ и ПЦР в реальном времени, используются в качестве экспресс методов и дополнительных чувствительных методов для диагностики бешенства (Fooks et al., 2009). Принцип лиссавирус специфической ПЦР состоит в обратной транскрипции целевой РНК (обычно части гена N) в комплементарную ДНК с последующей амплификацией кДНК с использованием ПЦР. Хотя эти молекулярные тесты имеют самый высокий уровень чувствительности, в настоящее время не рекомендуется их использовать для проведения плановой послеубойной диагностики бешенства (ВОЗ, 2005) из-за высоких уровней ложно-положительных или ложно-отрицательных результатов без стандартизации и очень строгого контроля качества. Тем не менее, будучи первым этапом типирования вируса, они полезны для подтверждающей диагностики (см. ниже).
1. 3. 4. Гистологическая идентификация клеточных поражений
Тельца Негри аналогичны скоплению вирусных белков, но классические методы окрашивания могут обнаружить только сходство этих структур с точки зрения ацидофильного окрашивания. Методы, применяемые для окрашивания частей погруженных в парафин клеток мозга (например, метод Mann), являются времязатратными, менее чувствительными и более дорогими, чем реакция флуоресцирующих антител. Метод Seller на незафиксированных образцах ткани имеет очень низкую чувствительность и подходит только для самых свежих образцов. Использование этих методов больше не рекомендуется для плановой
диагностики. Иммуногистохимические тесты являются единственными гистологическими методами специфичными к бешенству.
|
|
|
1. 4. Другие тесты для идентификации
Упомянутые выше тесты описывают методы точной диагностики бешенства, а также изоляции и идентификации вируса. Типирование вируса может способствовать получению полезной эпизоотологической информации и должно осуществляться в специализированных лабораториях (таких как референтные лаборатории МЭБ или ВОЗ). Эти методы включают использование MАт, зондов нуклеиновых кислот или полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим ДНК - секвенированием геномных областей для типирования вируса (Bourhy et al., 1993). Это позволяет проводить различие между вакцинным вирусом и полевым штаммом вируса и, возможно, устанавливать географическое происхождение последнего.
Приветствуется участие в межлабораторных сличительных испытаниях в рамках системы обеспечения качества: такие тесты должны быть организованы для Региональных Лабораторий Национальной Референтной Лабораторией, в то время как последние, в свою очередь, должны участвовать в международных сличительных испытаниях, организованных референтными лабораториями МЭБ.
2. Серологические тесты
Основное применение серологии в отношении классического бешенства состоит в определении реакции на вакцинацию как у домашних животных до международных перевозок, так и у популяций диких животных после пероральной иммунизации. В соответствии с рекомендациями ВОЗ (ВОЗ, 1985) минимальный измеримый титр антител, представляющий уровень иммунитета у человека, способный защитить от инфицирования бешенством, составляет 0, 5 МЕ/мл антител против вируса бешенства. Для подтверждения удовлетворительной реакции на вакцинацию та же процедура проводится на собаках и кошках. Так как нейтрализующие антитела являются ключевым компонентном адаптивной иммунной реакции против вируса бешенства (Hooper et al., 1998), то реакция вируснейтрализации (РН) является исследованием золотого стандарта. Однако был разработан непрямой иммуноферментный методИФА, который не требует наличие лабораторий с высоким уровнем защиты и дает быстрые результаты. Необходимо быть внимательным при сравнении результатов
|
|
|
реакции вируснейтрализации и ИФА, т. к. между ними существует значительное различие. В многочисленных публикациях говорится о переменной чувствительности и специфичность методов ИФА как у животных, так и у человека. Несмотря на то, что там, где требуется специфическая оценка защиты, рекомендуется проводить РН, для определения реакции на вакцинацию проведение обоих методов является полезным, при условии, что используются соответствующие точки раздела. Сыворотка плохого качества может быть причиной цитотоксичности РН, что может привести к ложно-положительным результатам. Было доказано, что для таких образцов непрямой метод ИФА может быть таким же чувствительным и таким же специфическим, как и реакция вируснейтрализации (Servat et al., 2007).
Серологические анализы так же используются для получения информации по динамике лиссавирусов у летучих мышей, но все еще требуется стандартизация серологических тестов, проводимых на летучих мышах.
|
|
|
