 |
Системы культивирования клеток
|
|
|
|
Существует 2 основных системы культивирования клеток.
1. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.
Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами:
- прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды);
- постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются);
- перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды. Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.
Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.
2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия. Характеризующиеся постоянством концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.
|
|
|
Существует 2 основных способа культивирования животных клеток: монослойные культуры и суспензионные культуры.
Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.
Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:
1. Монослойные культуры могут быть применены к любому типу клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость использования.
2. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.
3. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.
4. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.
5. В некоторых случаях, например для пассирования вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.
Недостатками монослойных культур являются:
1. необходимость большого пространства;
2. возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;
3. недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы и отсутствием информативности визуального анализа;
4. сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода и обеспечении гомогенности культуры клеток.
Существует много различных разновидностей этого способа культивирования. Рассмотрим три основных направления:
1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).
2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 15-20% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.
3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.
|
|
|
Монослойные культуры
Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату – к другим клеткам либо к стеклу (алюмо-боросиликатное стекло типа пирекс), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и др. при условии правильной обработки этих полимеров) - пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу – качественная медицинская нержавеющая сталь или титан.
Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхностной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо обеспечить поверхностный суммарный заряд субстрата, обеспечивающий прикрепление клеток.
Это может достигаться: 1) за счет электоростатического взаимодействий и 2) за счет присутствия внеклеточного биоматрикса.
1. Суммарный заряд поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно заряженных карбоксильных групп) может достигаться предварительным воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факторами (высоковольтный разряд, облучение УФ и др.), что облегчает электростатическое прикрепление клеток.
2. Поверхность культурального сосуда может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление клеток. К природным субстратам, на которых растут клетки относится коллаген. Другими излюбленными субстратами являются желатин и фибронектин. Возможно использование для этих целей полиаминокислот (поли-D-лизин), а также присутствие двухвалентных катионов кальция и магния.
В 1990 году группой японских ученых был разработан субстрат для культивирования клеток на основе поли-N-изопропилакриламида (ПНИПА), испытывающего фазовый переход из нерастворимого в растворимое в воде состояние при температуре около 33 °С, называемой нижней критической температурой сольватации (НКТС).
|
|
|
При температуре 37 °С полимер находится в нерастворимом состоянии, что позволяет использовать его в качестве твердого субстрата для культивирования клеток. Понижение температуры культивирования ниже НКТС вызывает гидратирование полимера и открепление клеток от поверхности субстрата без применения протеолитических ферментов и диссоциирующих агентов.
Культивирование на термочувствительной поверхности позволяет получать интактные культуры клеток и на протяжении многих пассажей поддерживать специфическую активность клеток.
Основным недостатком применяемых в настоящее время методик приготовления субстратов ПНИПА является необходимость ковалентного связывания ПНИПА с поверхностью для обеспечения устойчивой адгезии и роста культур клеток. В настоящее время для приготовления субстратов ПНИПА чаще всего используется метод полимеризации мономеров при помощи электронного луча высокой энергии непосредственно на поверхности, предназначенной для культивирования клеток.
К недостаткам данного метода также следует отнести ряд ограничений на тип покрываемой поверхности, необходимость проведения многократных промывок, для удаления непрореагировавших токсичных для клеток мономеров, а также то, что аппаратура, используемая для формирования электронного луча высокой энергии, недоступна большинству исследователей, работающих с культурами клеток.
Разработаны также методы фотоиндуцируемой полимеризации ПНИПА на поверхности полистирола, однако данные методы также подразумевают проведение ряда промывок и стерилизацию поверхности перед использованием ПНИПА в качестве субстрата для культивирования клеток.
Монослойное культивирование осуществляют во флаконах (флаконы Ру – самые большие стационарные флаконы, поверхностью до 200 кв.см или флаконах Колле) или пробирках для культуры тканей, обеспечивающих поверхность роста 5-200 кв.см.
Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение. Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфические движения клеточной мембраны. Первичные и другие нетрансформированные клетки, следовательно, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение плотного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени полностью сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии.
|
|
|
При достижении плотного монослоя наблюдается снижение распластывания клеток и их ошаривание.
Ослабленным контактным торможением характеризуются трансформированные клетки, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности, потому что эти клетки утрачивают зависящую от плотности регуляцию. Трансформированные клетки способны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не наступает смена среды, то клетки быстро погибают.
Клетки, трансформированные in vitro ретровирусом (вирус саркомы Рауса), несущим температурочувствительную мутацию в онкогене.
Округленная форма трансформированных клеток (34 °С)Те же клетки приобретают нормальную морфологию, когда продукт онкогена инактивируется повышением температуры (39 °С)
По мере роста клеточного монослоя нетрансформированных клеток происходят следующие изменения:
клетки становятся более скученными и менее распластанными, что приводит к уменьшению доли клеточной поверхности, обращенной к среде;
среда истощается по питательным компонентам, особенно в зоне, непосредственно примыкающей к клеткам.
Если из плотного монослоя нетрансформированных клеток удалить часть пласта, то в клетках, находящихся по краям удаленного участка, происходит стимуляция синтеза ДНК и делений. В результате клетки быстро зарастают освободившуюся поверхность.
Клеточную культуру перевивают после достижения ее плотного монослоя или когда добавленный в среду индикатор (обычно феноловый красный) меняет цвет с ярко-красного до желто-оранжевого.
Процесс подготовки клеточного монослоя к отделению от стекла и формированию суспензии вследствие обработки 0,02% раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1% трипсином и 0,01% ЭДТА происходит при комнатной температуре (или 37 °С) в течение 5-15 минут в зависимости от типа культуры и ее индивидуального состояния. Как только клеточный монослой достаточно разрыхляется и начинает отделяться от субстрата, дезинтегрирующий раствор сливают, а в сосуды заливают определенное количество ростовой среды. Этой средой тщательно смывают клетки со стенки сосуда и легким пипетированием способствуют образованию гомогенной взвеси.
|
|
|
После чего клетки центрифугируют при 200-400 – 1000 об/мин около 5 мин, и осадок отслоенных клеток ресуспендируют в свежей питательной среде. Оптимальная концентрация клеток в исходной посевной суспензии составляет 1-3х105 кл/мл. Однако можно и просто полученную взвесь после подсчета числа клеток разводить ростовой средой до посевной дозы.
Такие подходы используют не только для культивирования клеток в монослое, но и для перевода их в суспензию.
Помимо стационарного монослойного культивирования используют и динамическое.
«Роллерные культуры» - метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой. В силу определенных причин некоторое количество клеток может в отдельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте культуру клеток называют роллерно-суспензионной.
Для роллерного культивирования используются специальные стеллажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. Большое значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. Рекомендуется в течение первых 30 мин после засева клеток обеспечить высокую скорость вращения флаконов (1,0 об/мин) для равномерного распределения клеток, затем перевести их на более низкую скорость вращения (20 об/час).
Посевная концентрация в 1 мл среды составляет для клеток HeLa, L - 60-80 тыс., для диплоидных клеток 100-200 тыс., для первичных культур - 200-300 тыс. Объем ростовой среды должен составлять 1/10, 1/20 часть объема роллерного флакона.
Роллерный метод культивирования позволяет получить большие количества клеток. Преимуществом роллерных культур по сравнению с традиционными стационарными культурами является, в частности, более экономичное использование питательных сред.
|
|
|
