 |
Влияние света на развитие вегетативного мицелия
|
|
|
|
В литературе нет данных, которые свидетельствовали бы о необходимости света для развития вегетативного мицелия до начал плодообразования. Однако отмечено, что световое воздействиевлияет на морфологию культур. Отсутствие или наличие световогофактора в период роста вегетативного роста мицелия отражается
на характере дальнейшего плодоношения.Проводились исследования по изучению возможности пере-дачи светового воздействия по мицелию (Madelin, 1956; Robbins,Hervey, 1960). Разные авторы, исследуя разные грибы, получилипротиворечивые результаты. Одни исследователи утверждали, чтодействие света проявляется только на освещенных участках и ни-какой передачи по мицелию не происходит. Другие показали, чтопередача светового воздействия по мицелию может иметь место.
Относительно времени проявления фоточувствительности были высказаны и проверены две гипотезы: 1)
Репаративные процессы у грибов
Определяющее значение в устойчивости живых организмов к УФ-лучам принадлежит процессам фотореактивации и темновой репарации, способствующим восстановлению клеточного генома от лучевых повреждений (Эти процессы изучаются на широком круге объектов на популяционном, клеточном и молекулярном уровнях.
Фотореактивация— один из механизмов восстановления видимым светом (320—500 нм) повреждений ДНК, вызванных УФ-излучением.
Темновая репарация (ТР)— свойство клеток ликвидировать повреждения ДНК без участия видимого света.
Фотореактивация
Фотореактивацию, или восстановление на свету впервые наблюдал Kelner (1949) на грибе Penicillium notatum и Streptomyces sp. Это явление впоследствие было подтверждено на бактериях, грибах, вирусах, некоторых простейших, насекомых, культурах тканей животных и растений, на изолированных препаратах ДНК (Dulbecco, 1955; Jagger, 1958; Setlow, 1967; Самойлова, 1967; Дубров, 1968). Процесс фотореактивации происходит под действием спектрального света любой длины волны, кроме ультрафиолетового (Жестяников, 1979; Левин, 1979). Интенсивность его зависит от дозы и мощности излучения. Фотореактивация не наблюдалась при облучении микроорганизмов в сухом и замороженном состоянии (Левин, 1979). Этот процесс может происходить одновременно с облучением УФ-лучами, если последнее проводится на свету, поэтому УФ-облучение всегда проводят в темноте, а посев облученного материала — в затемненном помещении при красном свете.
|
|
|
Сущность процесса фотореактивации с участием фермента фотолиазы состоит в расщеплении на свету димеров пиримидиновых оснований, образующихся в ДНК при УФ-облучении, до мономеров. Единственным источником энергии, необходимой для активации фотолиазы, является видимый свет. Об этом свидетельствует одинаковая интенсивность процесса фотореактивации в присутствии кислорода и в анаэробных условиях, а также независимость его от ингибиторов дыхания (Самойлова, 1967; Смит, Хэнеуолт, 1972).
Наряду с ферментативной существуют и другие способы фотовосстановления пораженной структуры ДНК (Rupert, 1975; Harm, 1975; Жестяников, 1979).
Фотореактивацию микроорганизмов на клеточном уровне можно изучать с помощью разных методических приемов. Один из них состоит в освещении видимым светом предварительно облученной определенной дозой УФ-лучей клеточной суспензии и посевом ее через разные промежутки времени на питательную среду (Dulbecco, 1955; Jagger, 1958). Описанный метод позволяет выявить динамику процесса фотореактивации. По другому методу, выживаемость конидий определяли после облучения их разными дозами УФ-лучей с последующим однократным освещением видимым светом (Haynes, 1968; Sarachek, Greland, 1970; Pathrick, Sarachek, Pettriess, 1974; Moseley, Copland, 1975). Jagger (1958) предложена формула определения уровня фотореактивации:
|
|
|
Ph = (Ne — Nd): (No — Nd) ∙ 100,
где No — выживаемость клеток в необлученном контроле;
Nd — выживаемость клеток непосредственно после облучения;
Ne — выживаемость клеток на свету.
Е. Н. Кабаков и В. И. Корогодин (1966) математически описали динамику процесса фотореактивации для дрожжей Saccharomyces vini. Уравнение сводится к выявлению эффективной дозы Dt, которая определяется компонентой необратимого поражения, т. е. долей первичных поражений клеток, неспособных к фотореактивации, и скоростью самого процесса. Показателем процесса ферментативной фотореактивации на субклеточном уровне является восстановление активности УФ-облученной трансформирующей ДНК на свету в присутствии гомогената клеток исследуемого объекта (Cook, 1970). Механизм фотореактивации на молекулярном уровне к настоящему времени в значительной мере расшифрован, однако до конца не выяснены природа и механизм действия фермента фотолиазы, индуцирующего расщепление димеров ДНК до мономеров. Удалось выявить различия между фотолиазой грибного (дрожжи) и бактериального происхождения. Установлено, что фотолиаза Е. coli и Streptomyces griseus имеют белковую природу с молекулярной массой около 40 000 Д и не содержит субъединиц. Фотолиаза Saccharotnyces cerevisiae состоит из двух субъединиц (60 000—80 000 Д). По данным Rupert (1975), УФ-облученная ДНК специфична в стереохимическом отношении. Образовавшиеся пиримидиновые димеры имеют форму «седла» и только к ним присоединяется фотолиаза (Helene, Charlier, 1977). В опытах in vitro было показано участие производных индола в образовании межмолекулярных комплексов с основаниями облученной ДНК и сенсибилизация ими разрушения пиримидиновых димеров (Toulne et al., 1974; Charlier, Helene, 1975). Аналогичным образом действовал синтезированный полипептид типа лизин-триптофан-лизин. На свету в образовавшемся комплексе димер-индол электрон переносится с индольного кольца на димер, вызывая его расщепление. Расчетные данные энергетических уровней триплетного и синглетного состояния, например серотинина, а в ДНК — тимина и цитозина показали возможность переноса энергии от серотонина к ДНК. Таким образом, есть основания предполагать, что производные индола, подобно фотолиазе, могут осуществлять аналогичные процессы в живой клетке.
|
|
|
Сформулированная на этом основании гипотеза Helene объясняет необычно большое количество фермента фотореактивации у ряда биологических объектов, в том числе в клетках, которые никогда не освещаются солнечными лучами (печень глубоководной рыбы). Примечательно, что фотореактивация обнаружена в митохондриальной ДНК дрожжей, не имеющих фотолиазы.
Процесс фотореактивации (по критерию выживаемости) изучен на довольно ограниченном количестве видов гифальных и базидиальных грибов: Penicillium notatum, Р. chrysogenum (Kelner, 1949), Ustilago maydis (Jagger, 1958), Neurospora crassa и ее мутантах (Ferry, Kilbey, 1967), Aspergillus carbonarius (Curtis, 1970), Botrytis cinerea (Чеботарев, Землянухин, 1971). Способность дрожжей к фотореактивации исследована у 83 видов, относящихся к 12 совершенным и 10 несовершенным родам (Sarachek, Greland, 1970). Авторы показали ошибочность объединения в пределах одного рода видов, способных к фотореактивации и дефектных по этому признаку. Это подтвердили результаты других авторов, полученные с помощью цитологических, серологических и биохимических методов. Таким образом, фотореактивация у дрожжей изучается не только в связи с их устойчивостью к УФ-лучам, она имеет значение на уровне рода.
У дрожжей неспособность к восстановлению на свету, согласна существующим представлениям, — явление вторичное и обусловлено большей частью случайными мутациями. По выдвинутой авторами гипотезе, защита от УФ-облучения не всегда связана с фотореактивацией, так как роды, обладающие способностью к фотореактивации и дефектные по этому признаку, встречаются в одинаковых экологических нишах.
Мы изучали фотореактивацию у исходного штамма Cladosporium transchelii 396 и трех его мутантов — Ч-1, К-1 и БМ. Суспензию конидий каждого штамма облучали в течение 150, 15 и 5 мин соответственно, после чего в каждой из облученных суспензий оставалось 2% живых клеток (Жданова та iн., 1977).
Завершение фотореактивации у всех изученных культур наступало в среднем после 60—80-минутной экспозиции. Полученные характерные кривые восстановления не отличались от ранее известных на фагах, Е. coli, дрожжах (Dulbecco, 1955; Кабаков, Корогодин, 1966; Завольная, 1970). В большой степени фотореактивация выражена у мутанта БМ и светлоокрашенного мутанта К-1. После 2-часового освещения суспензий конидий этих грибов видимым светом выживало 80 и 55—60% конидий соответственно. Фотореактивация УФ-устойчивых исходной культуры С. transchelii и мутанта Ч-1 заканчивалась через 60 мин, выживаемость конидий у С. transchelii не превышала 15—20%, а у мутанта Ч-1 — 10%. Уменьшение степени фотореактивации устойчивых к УФ-лучам культур объясняется также присутствием меланина в оболочках конидий. Пигмент адсорбирует не только УФ-лучи, но и видимый свет, предотвращая поражение клеточного генома и активацию фотолиазы.
|
|
|
В условиях нашего эксперимента поражение ядерного аппарата, субстрата для фермента фотореактивации, примерно одинаково (выживаемость составляла 2%), а потому лимитирующим фактором в такой ситуации может быть активность фотолиазы. следовательно, при отсутствии или слабой меланиновой защите у высокочувствительных светлоокрашенных мутантов БМ и К-1, фотореактивация от УФ-повреждений происходит наиболее интенсивно. Несмотря на это обстоятельство, крайние по степени пигментации мутанты Ч-1 и БМ по устойчивости к УФ-облучению различались более чем на три порядка. Мы полагаем, что устойчивость изученных грибов наряду с фотореактивацией определяется фотозащитной функцией меланиновых пигментов. Для окончательного суждения необходимо провести эксперименты на изолированной облученной ДНК и гомогенатах соответствующих грибов.
Явление фотореактивации установлено для штаммов Neurospora crassa по критерию выживаемости и способности экстрактов гриба восстанавливать УФ-облученную изолированную ДНК (Ferry, Kilbey, 1967). Это свидетельствует о ферментативной природе процесса; он достигает максимума через 90 мин после облучения (Chang, Tuveson, 1967).
В естественных условиях микробные и грибные организмы подвергаются воздействию длинноволновых (ДУФ, 320 нм) и средневолновых УФ-лучей (СУФ, 280—315 нм), однако фотореактивация происходит только после облучения коротковолновыми (КУФ, 254 нм) и СУФ-лучами. Последние не поглощаются ядерной ДНК, но имеющиеся в цитоплазме фоторецепторы реагируют на это излучение, поглощенная ими энергия вызывает повреждение ДНК и нуклеиновых кислот (Левин, 1979). Продолжительное облучение УФ-лучами приводит к летальному повреждению белковых молекул, однако, подобно видимому свету, ДУФ-лучи способствуют фотореактивации от вызываемых СУФ- и КУФ-лучами повреждений.
|
|
|
В настоящее время значительно расширены представления о субстратах фотолиазы — к ним относятся не только пиримидиновые димеры, но фотопродукты, возникающие в РНК при облучении ее СУФ-лучами (Pollard, 1974; Левин, 1979). По-видимому, подобные исследования следует провести и на грибах.
Таким образом, явление фотореактивации изучено пока что на ограниченном количестве грибов. Детальное изучение этого процесса у дрожжей позволило выявить виды, способные и неспособные к фотореактивации. Неясно, насколько это свойство распространено среди других представителей огромного грибного царства. Пока не объяснены причины отсутствия фотореактивации у ряда видов грибов. На примере меланинсодержащих гифомицетов обнаружена зависимость интенсивности фотореактивации от содержания меланина в их клеточных оболочках.
|
|
|
