 |
Электронно-микроскопические методы в цитологии
|
|
|
|
1. Трансмиссионная электронная микроскопия.
2. Сканирующая электронная микроскопия.
3. Методы приготовления ультратонких срезов.
Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия (ТЭМ) основана на использовании пучка электронов, излучаемого электронной пушкой внутри колонны микроскопа в условиях высокого ускоряющего напряжения (40-100 кВ) и глубокого вакуума (10-4 мм рт. ст. ). Фокусировка пучка осуществляется электромагнитными линзами, играющими роль конденсора, объектива и проектора. После прохождения через изучаемый объект, помещенный в колонну и обладающий в различных своих участках неравномерной электронной плотностью, пучок электронов направляется на флюоресцирующий экран и создает плоскостное изображение объекта, которое фотографируется на пластинку или пленку.
Сканирующая (растровая) электронная микроскопия основана на сканировании электронным пучком поверхности изучаемого объекта, что достигается благодаря его отклонению специальным устройством (дефлектором). Вторичные электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью объекта, воспринимаются детектором и фокусируются на экране СЭМ, создавая ее трехмерное изображение. Разрешение СЭМ ниже, чем ТЭМ и составляет около 3-10 нм, его увеличение равно 20 тыс. раз.
Обработка материала для исследования в СЭМ включает его фиксацию, высушивание и напыление на его поверхность металлов (золота, палладия или др. ).
Обработка материала для исследования в ТЭМ методом ультратонких срезов:
Фиксация материала производится чаще всего глутаральдегидом; предпочтительно использование перфузионного метода. Дополнительная фиксация (постфиксация) производится четырехокисью осмия, который одновременно окрашивает клеточные структуры.
|
|
|
Заливка материала осуществляется в полимеризующиеся синтетические эпоксидные смолы.
Резка залитого материала производится на специальном приборе - ультратоме с помощью стеклянных или алмазных ножей. Толщина получаемых ультратонких срезов составляет 30-50 нм (необходимость получения очень тонких срезов обусловлена низкой проникающей способностью электронов).
Окрашивание (контрастирование) срезов выполняют с помощью солей тяжелых металлов (свинца, осмия, урана и др. ), которые в различной степени связываются с отдельными структурными компонентами, придавая им неодинаковую электронную плотность. Окрашенные ультратонкие срезы помещают на металлическую сетку и изучают в ТЭМ.
Общие принципы структурно-функциональной организации клетки
1. Компоненты клетки.
2. Классификация органелл клетки.
3. Принцип системности в организации клетки.
Компоненты клетки . Каждая клетка состоит из двух основных компонентов - ядра и цитоплазмы. В ядре находятся хромосомы, содержащие генетическую информацию, которая в результате процесса транскрипции постоянно избирательно считывается и направляется в цитоплазму, где она контролирует ход многообразных процессов жизнедеятельности клетки, в частности, сбалансированные процессы синтеза, анаболизма (от греч. anabole - повышение), и разрушения, катаболизма (от греч. kataballo - разрушаю). Указанные процессы осуществляются в цитоплазме благодаря
взаимодействию ее компонентов.
Компоненты цитоплазмы . Цитоплазма отделена от внешней (для данной клетки) среды внешней клеточной мембраной (плазмолеммой) и содержит органеллы и включения, погруженные в гиалоплазму (клеточный матрикс).
Органеллы - постоянно присутствующие в цитоплазме структуры, специализированные на выполнении определенных функций в клетке. Они подразделяются на органеллы общего значения и специальные органеллы.
|
|
|
(1) органеллы общего значения имеются во всех клетках и необходимы для обеспечения их жизнедеятельности. К ним относятся митохондрии, рибосомы, эндоплазматическая сеть (ЭПС), комплекс Гольджи, лизосомы, пероксисомы, клеточный центр, компоненты цитоскелета;
(2) специальные органеллы имеются лишь в некоторых клетках и обеспечивают выполнение их специализированных функций. К ним относят реснички, жгутики, микроворсинки, миофибриллы, акросому (спермиев). Специальные органеллы образуются в ходе развития клетки как производные органелл общего значения.
В состав многих органелл входит элементарная биологическая мембрана, поэтому органеллы подразделяют также на мембранные и немембранные. К мембранным органеллам относятся митохондрии, ЭПС, комплекс Гольджи, лизосомы, пероксисомы, к немембранным - рибосомы, клеточный центр, реснички, микроворсинки, жгутики, компоненты цитоскелета.
Включения - временные компоненты цитоплазмы, образованные в результате накопления продуктов метаболизма клеток. Подразделяются на несколько типов.
Мембранные структуры (компоненты) клетки - совокупное название различных структур цитоплазмы и ядра: плазмолеммы, ряда органелл, включений, транспортных пузырьков, а также ядерной оболочки (кариолеммы), в состав которых входят клеточные мембраны. Последние в различных мембранных структурах клетки организованы сходным образом, однако существенно различаются, в первую очередь, составом мембранных белков, определяющим специфику их функций.
Гиалоплазма (клеточный сок, цитозоль, клеточный матрикс) - внутренняя среда клетки, на которую приходится до 55% ее общего объема. Она представляет собой сложную прозрачную коллоидную систему, в которой взвешены органеллы и включения, и содержит различные биополимеры: белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, а также ионы. Претерпевает превращения по типу гель-золь. В гиалоплазме происходит большая часть реакций межуточного обмена.
При даже беглом рассмотрении компонентов эукариотической клетки можно выделить следующие структурно-функциональные системы:
|
|
|
система сохранения, воспроизведения и реализации генетической информации - ядро;
система промежуточного обмена — гиалоплазма;
рецепторно-барьерно-транспортную система - плазматическая мембрана, или
плазмалемма; система синтеза, сегрегации и внутриклеточного транспорта биополимеров (кроме нуклеиновых кислот) — эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы и другие одномембранные компартменты; каркасно-двигательная система - цитоскелет; система энергообеспечения — митохондрии; система фотосинтеза (автотрофные растительные организмы) - пластиды.
Строение и функциональное значение плазмолеммы
1. Структура плазмолеммы.
2. Функциональное значение плазмолеммы.
3. Механизмы мембранного транспорта.
Структура плазмолеммы . Плазмолемма - самая толстая из клеточных мембран (7, 5-11 нм); под электронным микроскопом она, как и другие клеточные мембраны, имеет вид трехслойной структуры, представленной двумя электронноплотными слоями, которые разделены светлым слоем. Ее молекулярное строение описывается жидкостно-мозаичной моделью, согласно которой она состоит из липидного (фосфолипидного) бислоя, в который погружены и с которым связаны молекулы белков.
Липидный бислой представлен преимущественно молекулами фосфатидилхолина (лецитина) и фосфатидилэтаноламина (цефалина), состоящими из гидрофильной (полярной) головки и гидрофобного (неполярного) хвоста. В состав большинства мембран входит также холестерин (холестерол). В мембране гидрофобные цепи обращены внутрь бислоя, а гидрофильные головки - кнаружи.
Мембранные белки составляют более 50% массы мембраны и удерживаются в липидном бислое за счет гидрофобных взаимодействий с молекулами липидов. Они обеспечивают специфические свойства мембраны (типы белков и их содержание в мембране отражают ее функцию) и играют различную биологическую роль (переносчиков, ферментов, рецепторов и структурных молекул). По своему расположению относительно липидного бислоя мембранные белки разделяются на две основные группы - интегральные и периферические.
|
|
|
Функции плазмолеммы определяются ее положением и включают:
1. Распознавание данной клеткой других клеток, и прикрепление к ним;
2. Распознавание клеткой межклеточного вещества и прикрепление к его элементам (волокнам, базальной мембране);
3. Транспорт веществ и частиц в цитоплазму и из нее (посредством ряда механизмов);
4. Взаимодействие с сигнальными молекулами (гормонами, медиаторами, цитокинами и др. ) благодаря наличию на ее поверхности специфических рецепторов к ним;
5. Движение клетки (образование псевдо-, фило- и ламеллоподий) - благодаря связи плазмолеммы с сократимыми элементами цитоскелета.
Мембранный транспорт веществ может включать однонаправленный перенос молекулы какого-то вещества или совместный транспорт двух различных молекул в одном или противоположных направлениях.
Пассивный транспорт включает простую и облегченную диффузию - процессы, которые не требуют затраты энергии. Механизмом простой диффузии осуществляется перенос мелких молекул (например, О2, Н2О, СО2); этот процесс малоспецифичен и протекает со скоростью, пропорциональной градиенту концентрации транспортируемых молекул по обеим сторонам мембраны. Облегченная диффузия осуществляется через каналы и (или) белки-переносчики, которые обладают специфичностью в отношении транспортируемых молекул.
Активный транспорт является энергоемким процессом, благодаря которому перенос молекул осуществляется с помощью белков - пересчиков против электрохимического градиента. Примером механизма, обеспечивающего противоположно направленный активный транспорт ионов, служит натриево-калиевый насос (представленный белком-переносчиком На+-К+-АТФазой), благодаря которому ионы Na+ выводятся из цитоплазмы, а ионы К+ одновременно переносятся в нее.
Облегченный транспорт ионов опосредуется особыми трансмембранными белками - ионными каналами, обеспечивающими избирательный перенос определенных ионов. Эти каналы состоят из собственно транспортной системы и воротного механизма.
Эндоцитоз . Транспорт макромолекул в клетку осуществляется с помощью механизма эндоцитоза (от греч. endo - внутрь и cytos -клетка). Материал, находящийся во внеклеточном пространстве, захватывается в области впячивания (инвагинации) плазмолеммы, края которого смыкаются с формированием эндоцитозного пузырька или эндосомы - мелкого сферического образования, герметически окруженного мембраной. Далее содержимое эндосомы подвергается внутриклеточной переработке (процессингу).
Рецепторно-опосредованный эндоцитоз . Эффективность эндоцитоза существенно увеличивается, если он опосредован мембранными рецепторами, которые связываются с молекулами поглощаемого вещества или молекулами, находящимися на поверхности фагоцитируемого объекта - лигандами (от лат. ligare - связывать). В дальнейшем (после поглощения вещества) комплекс рецептор-лиганд расщепляется, и рецепторы могут вновь возвратиться в плазмолемму.
|
|
|
Окаймленные пузырьки и ямки . Рецепторы макромолекул в плазмолемме, перемещаясь латерально по клеточной поверхности, могут, связывая свои лиганды, накапливаться в области формирующихся эндоцитозных ямок. Очень часто вокруг таких ямок и образующихся из них пузырьков со стороны цитоплазмы собирается сетевидная оболочка из белка клатрина, которая на срезах имеет вид щетинистой каемки. В покрытых клатриновой оболочкой (окаймленных) ямках рецепторные белки мембраны вытесняют все остальные; таким образом ямки действуют как приспособления для накопления и сортировки молекул.
Экзоцитоз (от греч. ехо - наружу и cytos - клетка) - процесс, обратный эндоцитозу, при котором мембранные экзоцитозные пузырьки приближаются к плазмолемме и сливаются с ней своей мембраной, которая встраивается в плазмолемму. При этом содержимое пузырьков (продукты собственного синтеза клетки или транспортируемые ею молекулы, непереваренные и вредные вещества и др. ) выделяется во внеклеточное пространство.
Трансцитоз (от лат. trans - сквозь, через и греч. cytos - клетка) процесс, харак-
терный для некоторых типов клеток, объединяющий признаки эндоцитоза и экзоцитоза. На одной поверхности клетки формируется эндоцитозный пузырек, который переносится к противоположной поверхности клетки и, становясь экзоцитозным пузырьком, выделяет свое содержимое во внеклеточное пространство.
Пиноцитоз (от греч. pinein – пить и cytos – клетка) – захват и поглощение клеткой жидкости и (или) растворимых веществ; подразделяется на макропиноцитоз (диаметр эндосом 0, 2-0, 3 мкм) и микропиноцитоз (диаметр эндосом 70-100нм).
Фагоцитоз (от греч. phagein – поедать и cytos – клетка) – захват и поглощение клеткой плотных, обычно крупных (разером более 1 мкм) частиц; обычно сопровождается образованием выпячиваний цитоплазмы – псевдоподий, охватывающих объект фагоцитоза и смыкающихся над ним.
Мембранные рецепторы являются преимущественно гликопротеинами, которые расположены на поверхности плазмолеммы клеток и обладают способностью высокоспецифически связываться со своими лигандами. Они выполняют ряд функций:
(1) регулируют проницаемость плазмолеммы, изменяя конформацию белков е ионных каналов;
(2) регулируют поступление некоторых молекул в клетку;
(3) действуют как датчики, превращая внеклеточные сигналы во внутриклеточные;
(4) связывают молекулы внеклеточного матрикса с цитоскелетом; эти рецепторы, называемые интегринами, играют важную роль в формировании контактов между клетками и клеткой и компонентами межклеточного вещества.
|
|
|
