 |
содержащего флавоноиды
|
|
|
|
Задание 1. Выделите флавоноиды из лекарственного растительного сырья для проведения качественных реакций и хроматографического анализа.
Методика. 3—5 г измельченного растительного сырья заливают 30—50 мл 70 %-ного спирта в колбе с обратным холодильником и проводят экстрак-цию на водяной бане в течение 20—30 мин. Извлечение охлаждают, фильтру-ют через 4 слоя марли или фильтровальную бумагу. Полученный фильтрат наносят на колонку диаметром 1 см, заполненную 1, 0 г полиамидного сор-бента, промывают 50 мл воды и элюируют флавоноиды с колонки 70 %-ным этанолом, отбирая фракцию, окрашенную в желтый цвет. Полученный элю-ат упаривают до 1/2 объема и используют для проведения качественных ре-акций и хроматографического анализа флавоноидов.
Задание 2. Проведите качественные реакции на флавоноиды с извлечением из ЛРС. В качестве образца сравнения используйте 0, 1 % ный спиртовый раствор рутина. Запишите результаты реакций (табл. 8. 2). Сделайте выводы.
Т а б л и ц а 8. 2
Результаты качественных реакций на флавоноиды
Опыт 1. Цианидиновая реакция. К 1 мл извлечения прибавляют 2—3 кап-ли кислоты хлористоводородной концентрированной и 1—2 щепотки метал-лического магния. Наблюдают образующуюся окраску.
Опыт 2. Цианидиновая реакция по Брианту. К окрашенному продукту ци-анидиновой реакции добавляют 1/3 часть октанола или бутанола по объему, разбавляют водой до разделения слоев, встряхивают и отмечают переход пигментов в водную или органическую фазы. Пигменты гликозидов остаются в воде, а агликоны переходят в слой органического растворителя.
Опыт 3. Реакция со щелочью. К 1 мл извлечения прибавляют 1—2 капли 10 %-ного спиртоводного раствора калия или натрия гидроксида. Раствор желтеет или усиливается естественная желтая окраска.
|
|
|
Опыт 4. Реакция с алюминия хлоридом. К 1 мл извлечения прибавляют
1 мл 2 %-ного спиртового раствора алюминия хлорида. Наблюдают образую-щуюся окраску.
Опыт 5. Реакция с железа (III) хлоридом. К 1 мл извлечения прибавляют 2—3 капли 1 %-ного спиртового раствора железа хлорида. Образуется темно-зеленая или коричневая окраска в зависимости от класса флавоноидов.
1 3 0 Фенольные соединения. Тема 8. Флавоноиды
Опыт 6. Реакция Вильсона. К 2 мл извлечения прибавляют 1 мл 2 %-ного раствора кислоты борной и 1 мл 2 %-ного спиртового раствора кислоты ли-монной (или щавелевой). При наличии 5-оксифлавонов и 5-оксифлавонолов наблюдают появление ярко-желтого окрашивания.
Опыт 7. Реакция с ванилином в кислоте хлористоводородной концентриро-ванной. К 1 мл прибавляют несколько капель 1 %-ного раствора ванилина
в кислоте хлористоводородной концентрированной. Окраска зависит от класса флавоноидов, преобладающих в экстракте.
Задание 3. Проведите качественную реакцию идентификации корней стальника, основанную на флюоресценции изофлавоноидов в УФ свете. Запишите на блюдение и выводы в лабораторный журнал.
Методика. Около 0, 2 г порошка корней стальника помещают в колбу со шлифом вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл 70 %-ного спирта и нагревают
с обратным холодильником на кипящей водяной бане при слабом кипении в течение 20 мин. После охлаждения раствор фильтруют через бумажный фильтр.
На полоску фильтровальной бумаги наносят микропипеткой 0, 05 мл из-влечения и просматривают в УФ-свете. Наблюдается голубая флюоресценция, усиливающаяся при обработке пятна парами аммиака (изофлавоноиды).
Задание 4. Проведите хроматографический анализ флавоноидов в ЛРС. Рассчитайте величины Rf. Зарисуйте схему хроматограммы в лабораторном жур нале, пронумеруйте пятна флавоноидов. Результаты наблюдений оформите
|
|
|
в виде табл. 8. 3. Сделайте заключение о составе флавоноидов в извлечении.
Т а б л и ц а 8. 3
Методика. 5 мл очищенного экстракта (задание 1) упаривают досуха на водяной бане в выпарительной чашке. Остаток растворяют в 0, 5 мл спирта, наносят его на две пластинки, покрытые слоем силикагеля. В качестве стан-дартов используют растворы рутина и кверцетина. Пластинки помещают в камеры с системами растворителей:
а) для агликонов: этилацетат—кислота муравьиная—вода (70: 15: 17);
б) для гликозидов: метанол—кислота уксусная—вода (18: 1: 1) или
хлороформ—метанол—вода (20: 14: 3).
После продвижения фронта растворителей на 10—11 см хроматограмму высушивают в вытяжном шкафу, отмечают пятна флавоноидов в видимом
и УФ-свете до и после обработки 10 %-ным спиртовым раствором натрия гидроксида.
NB! По указанию преподавателя выполните задание 5 или 6 по определе-нию количества флавоноидов в анализируемом сырье.
Задание 5. Определите количественное содержание флавоноидов в травезверобоя по ст. 52 ГФ XI. Сделайте заключение о соответствии образца сырья требованиям АНД (не менее 1, 5 % суммы флавоноидов).
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1, 0 г (точная
| Химический анализ ЛРС, содержащего флавоноиды | 1 3 1 | |
навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью
150 мл, прибавляют 30 мл 50 %-ного спирта. Колбу присоединяют к обратно-му холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее из-влечение фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Вату помещают в колбу для экстрагирования и прибавляют 30 мл 50 %-ного спирта. Экстракцию повто-ряют еще дважды в описанных выше условиях, фильтруя извлечение в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводят 50 %-ным спир-том до метки и перемешивают (раствор А).
|
|
|
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, 2 мл раствора алюминия хлорида в 95 %-ном спирте и доводят объем раствора
95 %-ным спиртом до метки. Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл извлечения и 1 капли кислоты уксусной разведенной и доведенный
95 %-ным спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного об-
разца (ФСО) рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое
сырье Х, %, вычисляют по формуле
0 100 . 100 . 100
Х = —————————————, D0. m. 100. (100 – W)D. m.
где D — оптическая плотность испытуемого раствора;
D 0 — оптическая плотность раствора ФСО рутина; m — масса сырья, г;
m0 — масса ФСО рутина, г;
W — потеря в массе при высушивании сырья, %.
П р и м е ч а н и е. Приготовление раствора стандартного образца (ФСО) рутина:
около 0, 05 г (точная навеска) ФСО рутина, предварительно высушенного при темпе-ратуре 130—135 °С в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95 %-ного спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.
Задание 6. Проведите количественное определение изофлавоноидов в корнях стальника. Сравните полученные результаты с числовыми показателями ЛРС
и сделайте заключение о соответствии исследуемого образца требованиям АНД по количеству изофлавоноидов (не менее 1, 5 %).
П р и м е ч а н и е. Изофлавоноиды извлекают из образца ЛРС 70 %-ным спиртом. Максимум поглощения спиртового экстракта при длине волны 260 нм совпадает
с максимумом поглощения изофлавоноида ононина, который используется в ка-
честве стандартного образца.
|
|
|
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 2, 0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую плоскодонную кол-бу вместимостью 100 мл с притертой пробкой, прибавляют 40 мл 70 %-ного спирта, закрывают колбу пробкой и взвешивают (с погрешностью +0, 01 г). Затем колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают содержимое колбы на водяной бане до кипения и поддерживают слабое кипение в тече-ние 2 ч. После охлаждения колбу вновь закрывают пробкой, взвешивают, убыль в массе восполняют 70 %-ным спиртом и настаивают при периодиче-ском взбалтывании в течение 1 ч. Затем извлечение фильтруют через сухой бумажный фильтр в сухую колбу вместимостью 50 мл, отбирают пипеткой
1 3 2 Фенольные соединения. Тема 8. Флавоноиды
0, 5 мл фильтрата, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора 70 %-ным спиртом до метки. Оптическую плотность получен-ного раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 260 нм
в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 70 %-ный спирт.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ФСО ононина. Содержание изофлавоноидов в пересчете на абсолютно сухое сырье
в процентах Х, %, вычисляют по формуле
D · 40 · 100 · 100 · 100
Х = ——————————————, 715 · m · 0, 5 · (100 – W )
где D — оптическая плотность испытуемого раствора;
715 — удельный показатель поглощения ононина в 70 %-ном спирте при длине волны 260 нм;
m — масса навески сырья, г;
W — потеря в массе при высушивании сырья, %.
? 
|
|
|
