 |
Методы изучения протеолитич. Акт. Бактерий(р. На индол, сероводород и др.)
|
|
|
|
Протеолитическая активность – это способность микроорганизмов расщеплять белки с образованием различных продуктов (H2S, NH3, индола и т.д.). Изучение этих свойств применяется для идентификации бактерий.
2. Протеолитические свойства бактерий изучают:
а) по способности разжижать желатин: делают посев изучаемой культуры бактерий уколом в столбик мясопептонного желатина (МПБ + 10-20 % желатина) и оставляют при комнатной температуре (20-22° С) на несколько дней. Через 3-5-10 дней просматривают посевы и отмечают форму разжижения желатина, характерную для различных видов микробов. Разжижать желатин способны микробы, выделяющие фермент типа коллагеназы;
б) по конечным продуктам распада белков: делают посев на МПБ и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 2-3 дней; для определения продуктов распада белков (индола, аммиака, сероводорода) используют специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ.
Индол обнаруживают по способу Мореля, для чего используют индикаторную бумажку, смоченную насыщенным раствором щавелевой кислоты, которая розовеет при образовании индола. Для обнаружения аммиака используют лакмусовую бумажку, в присутствии которого она синеет. Для обнаружения H2S используют полоску фильтровальной бумаги, смоченную уксуснокислым свинцом, которая чернеет в присутствии H2S.
Заражение куриного эмбриона(вирусологич. Метод)
Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения: на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полость, в желточный мешок. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением.
|
|
|
1этап
Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, обжигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0,05 - 0,2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой.
II этап
Вскрытие эмбрионов проводят через 48-72 часа инкубации в термостате. Наличие вируса в хорион-аллантоисной оболочке определяют:
1. по белесоватым непрозрачным пятнам разной формы;
2. в реакции гемагглютинации.
РГА
Реакция гемагглютинации- это один из методов индикации вирусов. Ставится двумя методами:
1) капельным на стекле;
2) в пробирках - развернутая реакция.
Компоненты:
1) исследуемый материал: аллантоисная жидкость, суспензия
хорионаллантоисной оболочки куриного эмбриона, экстракт из
культуры клеток, зараженных вирусом;
2) 5% взвесь куриных эритроцитов;
3) физиологический раствор.
На чистое обезжиренное стекло наносят 1 каплю взвеси эритроцитов и 1 каплю исследуемого материала.
При «+» результате - хлопья агглютинации эритроцитов.
Методы индикации и титрования бактериофагов по грация и аппельману
А. Выделение бактериофага проводят по следующему алгоритму.
1. Материал, их которого выделяется бактериофаг (объект внешней среды или бактериальная культура), фильтруют через бактериальный фильтр.
2. Фильтрат помещают в жидкую питательную среду, куда засевают чувствительную к выделяемому фагу бактериальную культуру.
3. После термостатирования проводят учет опыта.
а. Рост бактерии свидетельствует об отсутствии в исследуемом материале искомого бактериофага.
б. Отсутствие роста бактерий свидетельствует, что искомый бактериофаг в исследуемом материале присутствует.
Б. Титрование бактериофага проводят или по методу Аппельмана или по методу Грациа.
1. Титрованием фага по Аппельману можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до порядка. Для этого используется жидкая питательная среда.
а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в жидкой питательной среде.
б. Каждое разведение засевается чувствительной к данному фагу бактериальной культурой.
в. Посевы инкубируются в термостате.
г. Последнее разведение фагосодержащего материала, в котором не будет роста – это и есть титр бактериофага.
2. Титрованием фага по Грациа можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до одной фаговой корпускулы.
а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в полужидкой питательной среде.
б. К каждому разведению добавляется чувствительная культура с таким расчетом, чтобы в отсутствие бактериофага получился рост в виде газона.
в. Каждое разведение фагосодержащего материала в полужидкой среде с добавлением чувствительной культуры заливается в чашку Петри на слой плотной питательной среды, используемой в роли под-ложки.
г. Посевы инкубируются в термостате.
д. Низкие разведения бактериофага полностью лизируют бактерии и роста не наблюдается. По мере разведения фага появляются отдельные изолированные бляшки, каждая из которых – результат репликации одной фаговой корпускулы. Для подсчета титра бактериофага следует количество бляшек умножить на то разведение, в котором эти бляшки подсчитаны.
|
|
|
Реакция фаголизиса
Реакция фаголизиса ставится для идентификации возбудителя дизентерии.
Постановка реакции:
1) чистая культура шигелл на скошенномагаре;
2) 2 пробирки с МПБ - «опыт» и «контроль»;
3) дизентерийный бактериофаг
На I этапе:
1) Проверка культуры шигелл на чистоту (окраска по Граму);
2) Посев в 2 пробирки с МПБ
3) В пробирку «опыт» добавить 2 капли (0,1 мл) дизентерийного
бактериофага;
4) Посевы инкубировать в термостате 18-20 часов при темпратуре 37°С
На II этапе:
1) Регистрация результатов посева
|
|
|
В пробирке «контроль» имеется равномерное помутнение МПБ, т.к. культура шигелл оказалась жизнеспособной. В пробирке «опыт» МПБ прозрачный, т.е. дизентерийный бактериофаг вызвал лизис одноименной культуры бактерий.
Определение фаготипа
Определение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий. Цели фаготипиривания:
1. Помощь эпидемиологу в выявлении источников и путей
циркуляции инфекции при внутрибольничном
заражении;
2. Для идентификации микроба.
Определение фаготипа стафилококка проводят при помощи фагов, разведенных до тест- разведения, обозначенного на этикетке. Каплю 4-х часовой бульонной культуры распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18 часов* при температуре 37°С. На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который в тест-разведении вызывает её полный лизис. В зависимости от чувствительности культуры к фагу наблюдается разная степень лизиса:
+ + + + - сплошной лизис
+ + + - сливной лизис с вторичным ростом
+ + - более 50 негативных колоний (стерильных пятен)
+ - единичные негативные колонии (стерильные пятна)
- лизиса нет
Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенныхэшерихий (24 типа).
ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации ДНК invitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.
В основе метода ПЦР лежит природный процесс — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.
|
|
|
Способы учета результатов ПЦР:
Качественная оценка (электрофоретический метод)
Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "да" или "нет", как, например, при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др. Обычным способом разделения продуктов ПЦР и идентификации специфического гена является электрофорез в агарозном или (реже) полиакриламидном геле. Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным - в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена. Положительный контроль может представлять собой целевую ДНК или участок гена, клонированный в плазмиде или амплифицированный с помощью ПЦР
Для учета результатов качественной ПЦР может быть использован и метод флуоресцентной детекции. Для этого по окончании ПЦР определяют наличие или отсутствие специфического сигнала с помощью специальныхфлуориметров (так называемый flash-метод). Поскольку здесь нет необходимости и в электрофоретическом оборудовании, то очевидна существенная экономия рабочих зон и реагентов для лаборатории.
Методы учета результатов ПЦР без применения электрофореза наиболее уместны и выгодны для многопрофильных лабораторий, где ПЦР-методы составляют лишь некоторую часть общего производственного процесса.
В таких крупных лабораториях часто определяется лишь ограниченный круг наиболее востребованных микроорганизмов. На российском рынке предлагается целый ряд flash-наборов для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, и ряда вирусных инфекций. Этот ассортимент патогенов вполне достаточен для многих больничных лабораторий, и они могут с начала своей деятельности сделать акцент на подобных методах анализа.
|
|
|
