Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!
МегаЛекции

Идентификация бактерий по ферментативной активности




Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.

Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Через 3—5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты — индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

Для многих микроорганизмов таксономическим признаком с-лужит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают поплавки или используют полужидкие среды с 0,5% агара.

Для того чтобы определить интенсивное кислотообразование, характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный — при более низких значениях рН.

Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды.

При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин — промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свидетельствует о наличии бутандиолового брожения.

Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1 % раствором перекиси водорода.

Для определения цитохромоксидазы применяют реактивы: 1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1; 2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидрохлорида. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2—5 мин.

Для определения нитритов используют реактив Грисса: появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

 

26. Заражение куриного эмбриона.

Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения; на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и ам-ниотическую полость, в желточный мешок. Перед-заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением. Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, обжигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0.05 — 0.2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой.

Вскрытие эмбрионов производят через 48 — 72 часа инкубации в термостате. Наличие вируса в хролантоиской оболочке определяют:

1. По белесоватым непрозрачным пятнам разной формы;

2. В реакции гемаглютинации.

 

 

Метод индикации вирусов.

I. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопаттескому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически по морфологическим из­менениям клеток.

а) Часть таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. б) Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплош­ного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточ­ные островки.

Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних вирусов (парамиксовиру-сы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация кле­ток. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая культуру клеток под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом. Не­которые вирусы (энтеровирусы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4^-6-й день). Характер ЦПД используют как для обнаружения вирусов (индикации), так и ориентировочной идентификации, т.е. оп­ределения их видовой принадлежности.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Форма включений различна, а размеры колеблются от 0,25 до 25 мкм. Они представляют собой места скопления вирусных частиц и могут быть выявлены в препара­тах, приготовленных из зараженной ткани и окрашенных флюорохромами. В послед­нем случае используют люминесцентную микроскопию.

Для исследования морфологии контаминированных клеток используют специальный инвертированный микроскоп, у ко­торого осветитель располагается сверху, а объективы — снизу от предметного столика. С помощью такого прибора можно оценивать морфологию клеток, растущих в виде монослоя на поверхности контейнера для культивирования. Морфологичес­кие изменения клеток выявляют при микроскопическом ис­следовании культуры с помощью объектива 8х или 40х. При сравнении клеточного монослоя, инфицированного вирусом, с незараженными клетками в контрольной пробе отмечают полное или островковое разрушение пласта клеток либо другие изменения, которые характеризуют ЦПД вируса. Для более детального изучения ЦПД в контейнер для культивирования помещают покровное стекло, на котором образуется монослой. В дальнейшем стекло извлекают, зараженные клетки фиксиру­ют и готовят микроскопический препарат, который окрашива­ют флюорохромами и т.д.) и изучают иммерсионным методом.

ЦПД вирусов можно также продемонстрировать с помощью "цветной пробы": метаболически активные клетки культуры в ходе жизнедеятельности выделяют кислые продукты, что вы­зывает изменение цвета индикатора, присутствующего в культуральной среде. При репродукции вируса клетки утрачивают способность к метаболизму и погибают, поэтому окраска среды с течением времени не меняется.

II. Реакцию гемагглютинации (РГА) применяют для обна­ружения гемагглютинирующих вирусов в культуральной жид­кости зараженной культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Гемагглютинацию — "склеивание" эритроцитов разных видов животных (кур, гусей, морских свинок) — вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин. Для постановки реакции гемагглюти­нации к исследуемому материалу добавляют взвесь эритроцитов. В присутствии вирусов происходит агглютинация эритроцитов.

Более точным количествен­ным методом учета отдель­ных вирусных частиц являет­ся метод бляшек. Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тон­ким слоем агара. После ин­кубирования посевов в тече­ние нескольких суток на по­верхности агара появляются просветленные участки опре­деленной формы (бляшки), представляющие собой участ­ки погибших клеток в сплош­ном монослое культуры клеток. Каждая бляшка образуется при размножении одной ви­русной частицы и хорошо заметна в виде круглого светлого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным. Титр вируса, установленный этим ме­тодом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Размеры, морфология и сроки появления бляшек разли­чаются не только у разных видов вирусов, но и у отдельных штаммов одного и того же вида. Перечисленные признаки используют для селекции штаммов и получения так называе­мых чистых линий вирусов.

 

Поделиться:





Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 megalektsii.ru Все авторские права принадлежат авторам лекционных материалов. Обратная связь с нами...