 |
Методы культивирования анаэробов.
|
|
|
|
1) Физические методы основаны на создании вакуума в спец аппаратах-анаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либр другим газом, например углекислым газом. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика чахарного агара или среды Вильсона-Блера, налитых в пробирки в расплавленном состоянии и остуженных до 43 градусов. По методу Вейона-Виньола расплавленный и остуженный агар с посевным материалом набирают в стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.
2) Химические методы заключаются в том, что при культивировании исследуемого материала на плотнвх средах в эксикатор помещают хим в-ва, напр пирогаллом и щелочь, р-ция между которыми идет с поглощение кислорода. В жид питательные среды можно добавлять различные редуцирующие в-ва, аскорбиновую или тиогликолевую кислоту.
3)Биологические методы осонованы на оновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных пит средах в чашках Петри, герметически закупоренных. В начале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на др половине. Наиболее удобна для культивирования анаэробов среда Китта-Тароцци. В нее входит сахарный МПБ, который наливают в пробирки в кол-ве 10-12 мл и кусочки вареных паренхиматозных органов. перед употреблением среду Катти-Тароцци кипятят на водяной бане для удаления растворенного в ней кислорода. Средузаливают сверху стерильным вазелиновым маслом. Заметный рост анаэробов может наблюдаться через 48 ч и более в зависимости от кол-ва посевного материала.
Метод Дригальского.
|
|
|
Механические методы:
1. Посев уколом в столбик сахарного агара.
2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.
3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиологическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Содержимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают анаэробы.
Физические методы:
1. Анаэростат — создание вакуумных условий.
2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).
3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,
Химические методы
1. Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пирогаллол.
2. Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета -сернистое железо.
Биологический метод Фортнера
Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну половину засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.
|
|
|
Классификация бактерий по типу дыхания.
Облигатные аэробы (возбудители туберкулеза, чумы, холеры) – микроорганизмы, для оптимального роста которых необходимо 21 % кислорода.
Облигатные анаэробы (возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции, бактероиды, фузобактерии) – бактерии, которые растут при отсутствии свободного молекулярного кислорода за счет процессов брожения. Они получают кислород из органических соединений в процессе их метаболизма. Некоторые из них не выносят даже незначительного количества свободного кислорода.
Факультативные анаэробы (стафилококки, ешерихии, сальмонели, шигели и другие) – приспособились, в зависимости от условий среды (наличию или отсутствию кислорода), переключать свои метаболические процессы с использованием молекулярного кислорода на брожение и наоборот.
Микроаэрофилы (молочнокислые, азотфиксирующие бактерии) – особенная группа микробов, для которых концентрация кислорода при культивировании может быть уменьшена до 2 %. Высшие его концентрации способны задерживать рост.
Капнеические (возбудитель бруцеллеза бычьего типа) – микроорганизмы, которые требуют, кроме кислорода, еще и до 10 % углекислого газа.
Ферменты бактерий
Микроорганизмы синтезируют различные Ферменты - специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов.
1.Оксидоредуктазы- катализируют окислительно- восстановительные реакции.
2.Трансферазы- осуществляют реакции переноса групп атомов.
3.Гидролазы- осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений.
4.Лиазы- катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.
5.Лигазы или синтетазы- обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.
6.Изомеразы - определяют пространственное расположение групп элементов.
В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов:
- конститутивные, синтез которых происходит постоянно;
|
|
|
- индуцибельные, синтез которых индуцируется наличием субстрата;
- репрессибельные, синтез которых подавляется избытком продукта реакции.
Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты. Экзоферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий- способность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие тканевые барьеры.
Примеры: гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость тканей (клостридии, стрептококки, стафилококки и многие другие микроорганизмы); нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточном пространстве (холерный вибрион, дифтерийная палочка, вирус гриппа и многие другие). К этой же группе относятся энзимы, разлагающие антибиотики.
В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существуетмикробиологическая (рабочая) классификация ферментов.
1.Сахаролитические.
2.Протеолитические.
3.Аутолитические.
4.Окислительно- восстановительные.
5.Ферменты патогенности (вирулентности).
Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белков- кислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный.
Основные ферменты вирулентности- гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии.
Ряд ферментов микроорганизмов широко используется в медицине и биологии для получения различных веществ (аутолитические, протеолитические), в генной инженерии (рестриктазы, лигазы).
|
|
|
