Схема титрования фага по Аппельману

ЗАНЯТИЕ 13

Тема: БАКТЕРИОФАГИ.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ.

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

 

Цель занятия: изучить строение и свойства вирулентных и умеренных бактериофагов, их взаимодействие с бактериальной клеткой, освоить качественные и количественные методы определения фагов.

Изучить фенотипическую и генотипическую изменчивость микроорганизмов, познакомиться с классификацией мутаций бактерий, оценить последствия изменчивости для бактериальных клеток. Познакомиться с процессами обмена генетической информацией у бактерий; изучить явления трансформации, коньюгации и трансдукции в бактериальных клетках; оценить роль умеренного бактериофага в переносе генетической информации, определить роль внехромосомных генетических элементов для бактерий, познакомиться с молекулярно-генетическими исследованиями

 

План занятия

 

1. Строение и свойства бактериофага.

2. Вирулентные и умеренные фаги. Их отличия, типы взаимодействия с микробной клеткой.

3. Взаимодействие вирулентного фага с бактериальной клеткой.

4. Умеренный бактериофаг. Явление лизогении и фаговой конверсии.

5. Применение бактериофага в практической медицине.

6. Качественные и количественные методы определения фагов. Методы выделения фага из объектов окружающей среды.

7. Фаготипирование бактерий.

8. Организация генетического материала бактерий. Репликация ДНК. Генотип и фенотип.

9. Изменчивость микроорганизмов и ее виды.

10. Модификации у бактерий.

11. Мутации у бактерий. Отличие мутаций от других видов изменчивости микроорганизмов. Классификация мутаций по происхождению, молекулярным механизмам и последствиям для бактериальной клетки.

12. Практическое использование учения о мутациях.

13. Рекомбинация – обмен генетической информацией.

14. Трансформация, ее механизм, основные этапы.

15. Конъюгация. Роль полового фактора. F⁺, F־, Hfr-клетки.

16. Трансдукция, ее механизм. Роль умеренного бактериофага.

17. Внехромосомные генетические структуры: строение, классификация, функции (плазмиды, транспозоны, Is-последовательности).

18. Молекулярно-биологические методы исследований в клинической практике (ПЦР, иммуноблотинг и др.)

19. Медицинская биотехнология.

20. Генетическая инженерия. Препараты медицинского и ветеринарного назначения полеченные методом генной инженерии.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

БАКТЕРИОФАГИ.

 

Рис 13.1 Взаимодействие бактериофага с оболочкой бактерии

Рис 13.2. Развитие умеренного фага

Методы изучения вирулентных фагов

Подготовка материала

Материалом, из которого выделяют фаг, обычно являются фильтраты, полученные с помощью бактериальных фильтров из объектов внешней среды, органов и выделений человека и животных, культур микроорганизмов и т. д.

Перед фильтрацией исследуемый материал подготавливают следующим образом:

Жидкости (кровь, мочу, воду, смывы с предметов и т. п.) освобождают от крупных частиц с помощью бумажного фильтра или центрифугированием, чтобы они не забили поры бактериального фильтра.

Вязкий материал (гной, кал) эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне, после чего освобождают от крупных частиц, как описано выше.

Плотный материал (кусочки органов, пищи и т. п.) предварительно измельчают - обычно растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Вместо песка можно использовать стерильные кончики пастеровских пипеток или битые покровные стекла. Растертый материал тщательно эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне и освобождают от крупной взвеси.

Подготовленный материал пропускают через бактериальный фильтр, освобождая от посторонней микрофлоры.

Культуры микроорганизмов (известные или изучаемые). В работе с фагом применяют 20-24-часовые культуры, выращенные на агаре, или 2-6-часовые культуры в жидких средах. Чистоту культуры устанавливают в мазках, окрашенных фуксином Пфейффера или по Граму. Из культур, выращенных на скошенном агаре, готовят взвесь. В пробирку с культурой наливают 3-5 мл изотонического раствора натрия хлорида. Вращая пробирку между ладонями, осторожно смывают культуру с поверхности среды так, чтобы не намочить пробку. Взвесь переносят в стерильную пробирку и разводят изотоническим раствором натрия хлорида 1:10 (0,5 мл взвеси в 4,5 мл раствора).

При работе с фагом необходима стерильная посуда (градуированные и пастеровские пипетки, чашки Петри, пробирки, колбы, ступки), термостат, фильтровальное устройство, центрифуга, штативы, прибор для счета колоний.

Внимание! Вся работа с фагом требует соблюдения асептики.

Качественные методы

О наличии фага в том или ином субстрате узнают по лизису чувствительной к нему микробной культуры (тест-культура).

Обнаружение фага на плотных средах. Тест-культуру засевают "газоном" (см. главу 7) на поверхность агара в чашке Петри. Посев подсушивают в термостате 30-40 мин при открытой крышке, после чего на него наносят каплю изучаемого материала. Через несколько минут, когда жидкость впитается, чашки помещают в термостат на 18-20 ч. Если в изучаемом материале есть фаг, произойдет лизис культуры и на месте, куда была нанесена капля, культура или совсем не вырастет (сплошной лизис) или образуются отдельные колонии фага.

Обнаружение фага в жидких средах. В две пробирки с одинаковым количеством бульона вносят по одной капле культуры, микроба, в отношении которого изучают фаг. В одну из них добавляют исследуемый фаг или фильтрат материала, в котором его определяют. Вторая пробирка служит контролем роста культуры. Пробирки помещают в термостат на 12-20 ч. Учет результатов производят только при наличии роста культуры в контроле (помутнение среды). Отсутствие видимого роста или последующее просветление среды в пробирке с исследуемым материалом свидетельствует о присутствии фага. Если содержимое этой пробирки мутное, исследование необходимо дополнить посевом на плотную среду: помутнение могло произойти от роста устойчивой к фагу культуры. Только в том случае, если в посеве на агар фаг не будет обнаружен, можно сделать вывод, что его нет в изучаемом материале.

Количественные методы

Количественные методы имеют большое значение при проведении многих исследований, в том числе и фага. Врачу нужно знать активность фага, чтобы правильно установить его дозу при лечебно-профилактическом применении, исследователю - чтобы выяснить, как изменяется активность фага в эксперименте.

Активность фага выражают понятием титр, различая титр фага в жидкой и на плотной среде.

При исследовании в жидкой среде (по Аппельману) титр фага - это наибольшее его разведение (или наименьшее количество), которое подавляет рост тест-культуры в условиях данного опыта.

На плотной среде (титрование по Грациа) титр фага - количество частиц (корпускул) фага в 1 мл исходного материала.

 

Титрование фага по Аппельману (в жидкой среде). При титровании фага объем и состав среды, температура, аэрация, количество микробов, пробирки, в которых проводят титрование (диаметр, конфигурация дна, толщина стекла), должны быть одинаковыми. Изменяется только количество фага.

Все компоненты, участвующие в биологических опытах, подлежат обязательному контролю на правильность их работы.

При титровании фага ставят контроль фага и бульона на стерильность, контроль культуры - на ее жизнеспособность.

Постановка опыта. 1. В 12 стерильных пробирок наливают по 4,5 мл стерильного бульона. Уровень жидкости во всех пробирках должен быть одинаковым. Если это не так, значит допущена ошибка. В этом случае нестандартную пробирку заменяют новой и заново наполняют бульоном. При разливе бульона пользуются пипетками вместимостью 5-10 мл.

2. Пробирки ставят в штатив и нумеруют от 1 до 10, на одной из оставшихся пробирок пишут "КК" (контроль культуры), на другой - "КФ" (контроль фага). Все пробирки, в которых проводят опыт, должны быть надписаны.

3. В десяти пробирках готовят последовательные десятикратные разведения фага от 10^-1 до 10^-10 (табл. 13.2). В 1-ю пробирку вносят 0,5 мл фага. Такое же количество вносят в пробирку контроля фага. Сменив пипетку, новой пипеткой тщательно перемешивают содержимое 1-й пробирки и переносят 0,5 мл его во 2-ю пробирку; 0,5 мл содержимого 2-й пробирки переносят в 3-ю и так далее до 10-й пробирки, меняя каждый раз пипетки. Перемешав содержимое 10-й пробирки, 0,5 мл жидкости из нее выливают в дезинфицирующий раствор. Также поступают с содержимым пробирки контроля фага. Для разведения фага пользуются пипетками вместимостью 1-2 мл. Проверяют уровень жидкости в пробирках. Он должен быть одинаковым.

 

 

Схема титрования фага по Аппельману

Таблица 13.2.

Ингредиенты, мл	Пробирки
опыт	контроль
										культуры	фага
Бульон (МПБ)	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5
Исследуемый фаг	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5	-	0,5
Культура м/о	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	-
	Разведение
10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	10-8	10-9	10-10	-	10-1
Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚C 18-20ч
Результат

Условные обозначения: + рост культуры, - отсутствие роста культуры.

 

Примечание. Стрелки указывают перенос фага из пробирки в пробирку. Из пробирки 10 и из пробирки контроля фага 0,5 мл выливают в дезинфецирующий раствор.

4. Во все пробирки, кроме пробирки контроля фага, вносят по 1 капле (0,05 мл) взвеси тест-культуры. Пробирки встряхивают. Во всех пробирках, кроме пробирки контроля фага, должна появиться слегка заметная муть. Если этого не происходит, все операции с нестандартной пробиркой повторяют вновь.

5. Пробирки помещают в термостат на 18-20 ч, после чего учитывают результат титрования. Учет результатов обязательно начинают с контролей.

При правильной постановке опыта в контроле культуры должно быть размножение бактерий - содержимое пробирки становится мутным. Этот контроль позволяет сделать вывод, что взятая в опыт культура жизнеспособна и что питательная среда обеспечивает ее развитие в данных условиях опыта. Значит, если в пробирках с фагом культура не выросла, на нее подействовал фаг.

Жидкость в пробирке с контролем фага должна остаться прозрачной. Этот контроль позволяет сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны.

При правильных результатах в контролях регистрируют характер изменений в первых десяти пробирках. Рост культуры в пробирках "опытного" ряда говорит об отсутствии или недостаточном количестве в них фага. Устанавливают титр фага, т. е. его наибольшее разведение, в котором произошел лизис культуры (содержимое пробирки прозрачно). Обозначают титр степенью разведения фага с обратным знаком, что соответствует порядковому номеру пробирки. Например, если культура не растет в первых семи пробирках, титр фага равен 10^-7.

Титрование фага по Грация (на плотной среде) методом агаровых слоев позволяет определить количество частиц фага в титруемом материале. Метод основан на том, что каждая частица фага дает зону просветления (лизиса) на чашке с газоном чувствительного к нему микроба, т. е. образует отдельную колонию.

Постановка опыта. Чашки с 20-25 мл МПА покрывают стерильной фильтровальной бумагой и подсушивают в термостате или под бактерицидной лампой (расстояние от лампы не более 2 м). Титруемый фаг разводят от 10^-1 до 10^-10 (как в предыдущем опыте) и по 1 мл переносят в другие пронумерованные пробирки (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й), в которые заранее наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45° С. В каждую из этих пробирок добавляют по 0,1 мл тест-культуры. Содержимое пробирок быстро перемешивают (не дать застыть агару) и выливают на поверхность среды в чашки Петри с номерами, соответствующими номерам пробирок. Через 30 мин чашки ставят в термостат.

Учет результатов проводят через 18-20 ч. При большой концентрации фага (в первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях фага, в которых находилось небольшое количество частиц фага, появятся изолированные колонии, которые подсчитывают. Чтобы не ошибиться в счете, каждую учтенную колонию помечают со стороны дна чашки. Аппарат для счета колоний намного облегчает работу (см. рис. 54). Чтобы установить количество частиц фага в 1 мл фаголизата, пользуются формулой: n = y×x, где n - искомое число; y - количество выросших на чашке колоний фага; x - разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии.

Например, если в чашке с разведением фага 10^-8 (1:10⁸) выросло 25 колоний, то в 1 мл исходной жидкости содержится 25×10⁸ или 2,5×10⁹частиц фага.

Более точные результаты получают, если определяют количество частиц фага в исходной жидкости по нескольким разведениям и вычисляют среднее арифметическое. Например, при разведении фага 10^-6 выросло 320 колоний, следовательно, в 1 мл исходной жидкости было 320×10 или 3,2×10⁸ частиц фага. При разведении фага 10^-7 выросло 42 колонии, следовательно, в исходной жидкости было 4,2×10⁸/мл частиц фага. При разведении фага 10^-8 выросло 5 колоний, следовательно, в исходной жидкости было 5×10⁸/мл частиц фага. Сложив величины, полученные при этих подсчетах и разделив сумму на 3 (количество проведенных подсчетов), устанавливают число частиц фага в 1 мл титруемого препарата. В нашем примере оно равно 4,1×10⁸.

Подсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и не больше 50 колоний. В противном случае страдает точность подсчёта. Если на чашке много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии на одном из них и полученную цифру умножить на количество секторов.

Как правило, все биологические исследования проводят в трех параллельных опытах. В данном примере каждое разведение фага одновременно титруют трижды.

Методы выделения фагов

Прямой метод. Фаг получают и изучают непосредственно в фильтратах исследуемого материала. О наличии и активности фага узнают по лизису чувствительной к нему культуры.

Как правило, прямой метод не дает убедительных результатов из-за малого количества содержащегося в фильтрате фага. Для повышения его количества используют методы обогащения.

Метод обогащения. Подготовленный фильтрат вносят в 2-3-часовую бульонную культуру соответствующих микроорганизмов. Посев инкубируют в термостате. Фаг размножается в клетках культуры и титр его значительно увеличивается. После этого бульон фильтруют и в фильтрате определяют свойства и активность фага.

123Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: