 |
1.2.4.2. Метод, разработанный Fechner et al., (1996)
|
|
|
|
1. 2. 4. 2. Метод, разработанный Fechner et al., (1996)
i) Строение праймера и последовательности
Размер продукта ПЦР BLV-env-1/ BLV-env-2 составляет 598 пар оснований. Размер продукта ПЦР BLV-env-3/ BLV-env-4 – 444пары оснований.
ii) Реакционные смеси
Реакционные смеси смешивают (за исключением образцов ДНК) перед добавлением в отдельные реакционные пробирки. На пять
образцов необходимо включить один отрицательный контроль (H2O, прошедшая двойную дистилляцию) и один положительный контроль. Общие объемы смесей рассчитывают путем умножения указанных объемов на общее число образцов, включая контроли, плюс один.
Первую ПЦР можно провести, используя 50µл объема реакционной смеси. Для одной реакции исследование оптимизируют до 5 µл (10× ) ПЦР буфера, 20 µл ДНК (~1 µг ДНК), по 1, 25 µл каждого из env-специфических праймеров BLV-env-1 и BLV-env-2 (20 пмоль/µл), 0. 15 дНТФ (каждый по 25 мМ), 3 µл MgCl2 (25 мМ), 0. 25 µл Taq полимеразы (1, 25 Е) и 19, 1 µл дистиллированной H2O. Для реакции используют следующий температурный режим: 2 минуты при температуре 94º С; 30 циклов по 30 секунд при температуре 95º С, 30 секунд при температуре 58º С и 60 секунд при температуре 72º С; после этого 4 минуты температуре 72º С.
Гнездовую ПЦР можно провести, используя 50µл объема реакционной смеси. Для одной реакции исследование оптимизируют до 3 µл продукта ПЦР, полученного в ходе первой ПЦР, 5 µл (10× ) ПЦР буфера, по 1, 25 µл каждого из env-специфических праймеров BLV-env-3 и BLV-env-4 (20 пмоль/µл), 0. 15 дНТФ (каждый по 25 мМ), 0. 25 µл Taq полимеразы (1, 25Е) и 36, 1 µл дистиллированной H2O. Для реакции используют следующий температурный режим: 2 минуты при температуре 94º С; 30 циклов по 30 секунд при температуре 95º С, 30 секунд при температуре 58º С и 60 секунд при температуре 72º С; после этого 4 минуты температуре 72º С.
|
|
|
iii) Лабораторная процедура
Смешивают реагенты для ПЦР для проведения первой или гнездовой ПЦР и при добавлении образцов ДНК в каждую пробирку используют новые перчатки или открывашку. Образцы помещают на лед. Термоблок нагревают до 94º С. Образцы помещают в термоблок и запускают соответствующую программу ПЦР.
iv) Электрофорез в агарозном геле
Примерно 10 µл продуктов гнездовой ПЦР и 20 µл загрузочного буфера загружают на 2% агарозный гель, содержащий 0, 01% бромид этидия. Электрофорез проводят, используя 0, 5 × Трис/борат/ЭДТК (ТБЭ) буфер, при 90 миллиампер в течение 2 часов. Для контроля размера продуктов амплификации рекомендуется использовать лэддер из 100 пар оснований. Анализ продуктов ПЦР производится с помощью УФ освещения.
v) Интерпретация результатов
a) Положительные образцы должны иметь продукты ПЦР ожидаемого размера (444 пары оснований), подобно положительному контролю.
b) Отрицательные образцы не должны иметь продуктов ПЦР ожидаемого образца (444 пары оснований).
c) Исследование необходимо повторить, если положительный контроль оказался отрицательным, или если отрицательный контроль (вода) стал положительным.
vi) Подтверждающее исследование
Для подтверждающей идентификации в отношении продуктов ПЦР можно провести секвенирование, гибридизацию с содержащим метку зондом или анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Fetcher et al., 1997).
2. Серологические тесты
КРС остается инфицированным вирусом на всю жизнь, что обеспечивает персистентную выработку антител. Впервые антитела можно обнаружить спустя 3-16 недель после инфицирования. Материнские антитела могут исчезнуть через 6-7 месяцев. Невозможно различить пассивно переданные антитела и антитела, которые выработались во время активной инфекции. При этом активную инфекцию можно подтвердить путем обнаружения провируса вируса лейкоза КРС с помощью ПЦР. Пассивные антитела могут защитить телят от инфекции. В околородовый период у коров могут иметься сывороточные антитела, которые невозможно обнаружить с помощью иммунодиффузии в агаровом геле по причине смещения антител из циркуляции внутри коровы в колострум. Таким образом, при проведении иммунодиффузии в агаровом геле отрицательные результаты в отношении сыворотки, отобранной в этот период времени (2-6 недель до и 1-2 недели после отела) не являются безусловно достоверными, и тест необходимо повторить. Однако, иммунодиффузию в агаровом геле можно провести на данной стадии, используя колострум первой фазы.
|
|
|
Проще всего обнаружить антитела, направленные на gp51 и р24 вируса. В большинстве случаев иммунодиффузия в агаровом геле и ИФА при рутинном использовании обнаруживают антитела к гликопротеину gp51, поскольку они появляются раньше. Опубликованы методы проведения данных тестов (Dimmock et al., 1987; Европейская Комиссия, 2009). ИФА, как правило, обладают более высокой чувствительностью по сравнению с иммунидиффузией в агаровом геле.
Слабые положительные и отрицательные референтные сыворотки МЭБ для проведения ИФА доступны в лиофилизированной облученной форме в Референтной лаборатории МЭБ в Германии (смотрите Таблицу в Части 4 данного Руководства по наземным животным). Калибровка данных сывороток основана на использовании аккредитованной референтной сыворотки МЭБ, которая имеет название Е05, валидированной против бывшей референтной сыворотки Е4 с помощью иммунодиффузии в агаровом геле и ИФА.
2. 1. Твердофазный иммуноферментный анализ (тест, предписанный для международной торговли)
Можно провести как непрямой, так и блокирующий ИФА. Тесты для проведения обоих анализов имеются в продаже; могут потребоваться разные наборы для образцов молока или сыворотки. Некоторые ИФА достаточно чувствительны для проведения с использованием объединенных образцов. ИФА проводят на микропланшетах для твердофазной экстракции. Планшеты сенсибилизируют антигеном вируса лейкоза КРС либо напрямую, либо с помощью иммобилизированного поликлонального или моноклонального антитела (MAb). Антиген готовят из супернатанта культуры клеток персистентно инфицированных вирусом лейкоза КРС линий клеток. Наиболее широко в коммерческих тестах используются клетки почек эмбриона овцы (FLK) (Van der Maaten & Miller, 1976). С 2004 года доступна новая линия клеток, продуцирующая вирус лейкоза КРС, РО714, которая является свободной от других вирусных инфекций и содержит провирус бельгийской подгруппы (Beier et al., 2004). Антиген используют в заранее установленном разведении (т. е. 1/10) в фосфатно-буферном растворе (ФБР). Что касается наборов, имеющихся в продаже – в некоторых планшеты уже сенсибилизированы. В образцы молока могут быть добавлены консерванты, чтобы предотвратить его скисание. Образцы с консервантами остаются пригодными для использования до 6 недель при условии хранения при температуре 4º С.
|
|
|
|
|
|
