 |
2.1.2.1. Контроли. 2.1.2.2. Пример процедуры тестирования. 2.1.2.3. Считывание и интерпретация результатов. 2.2. Иммунодиффузия в агаровом геле (тест, предписанный для международной торговли)
|
|
|
|
2. 1. 2. 1. Контроли
В каждое исследование должен быть включен сильный положительный, слабый положительный, отрицательный контроль молока и контроль разбавителя. Сильный положительный контроль готовят путем разведения референтной сыворотки МЭБ Е05 1/25 в отрицательном молоке. Слабый положительный контроль готовят путем разведения в отрицательном молоке референтной сыворотки МЭБ Е05 в 25 раз больше числа индивидуальных образцов молока в
пуле, подлежащем исследованию. Для разведения контролей референтных сывороток МЭБ используют не пастеризованное снятое консервированное молоко.
2. 1. 2. 2. Пример процедуры тестирования
i) Образцы молока хранят, не трогая, в холодильнике до тех пор, пока не образуется определенный слой сливок (24-48 часов) или, в качестве альтернативы, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Перед началом тестирования необходимо удалить слой сливок.
ii) Планшет сенсибилизируют в шахматном порядке антигеном вируса лейкоза КРС и контролем отрицательного антигена. 100 µл тестового образца добавляют к 100 µл промывочного буфера в планшете, чтобы получить разведение ½, помещают в две лунки с контролем антигена и в две лунки с антигеном вируса лейкоза КРС.
iii) Планшет запечатывают и перемешивают на шейкере.
iv) Планшет инкубируют в течение 14-18 часов при температуре 2-8º С.
v) В каждую лунку добавляют по 300µл промывочного растворителя, затем сливают. После этого в каждую лунку добавляют по 200 µл промывочного растворителя, встряхивают в течение 10 секунд и сливают. Наконец, добавляют по 300 µл промывочного растворителя, замачивают на 3 минуты и сливают.
vi) В каждую лунку добавляют по 200µл аффинно очищенного конъюгата антибовинного IgG с пероксидазой хрена, разведенного в промывочном растворителе, и инкубируют планшет в течение 90 минут при комнатной температуре.
|
|
|
vii) Планшет промывают путем добавления в каждую лунку по300µл промывочного растворителя; затем содержимое удаляют и снова добавляют по 300µл промывочного растворителя. Оставляют замачиваться на 3 минуты, затем содержимое сливают. Повторяют этапы vi и vii.
viii) В планшет добавляют 200µл субстрата ABTS (2, 2'-азинобис-[3-этилбензотиазолин-6-сульфониевая кислота]) (предварительно подогретого до 25 º С) и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. Реакцию можно остановить путем добавления 50 µл останавливающего раствора.
2. 1. 2. 3. Считывание и интерпретация результатов
ИФА ридер обнуляют вхолостую и затем считывают абсорбцию при длине волны в 405 нм. Все планшеты должны быть считаны в течение 2 часов после добавления останавливающего раствора. Считывание абсорбции лунок, содержащих отрицательный антиген, вычитают из считываний лунок с положительным антигеном. Следует усреднить два значения чистой абсорбции для каждого тестового образца. То же самое применяется в отношении параллельных слабоположительных контролей. Репликаты должны быть в пределах 0, 1 оптической единицы друг от друга.
Чтобы тест считался действительным, усредненная чистая абсорбция слабоположительных контролей должна составлять 0, 2-0, 6 оптических единиц. Чистая абсорбция сильноположительных контролей должна быть > 1, 0 оптических единиц. Чистая абсорбция отрицательных контролей и контроля разбавителя должна быть ниже, чем нижний предел неопределенного диапазона.
Если предположить, что все вышеперечисленные критерии соблюдены:
i) Тестовые образцы являются положительными, если значение их чистой абсорбции выше или равно значению чистой абсорбции слабоположительного контроля.
|
|
|
ii) Тестовые образцы являются неопределенными, если значение их чистой абсорбции составляет 75% или ниже значения чистой абсорбции слабоположительного контроля.
т. е. если чистая абсорбция слабоположительного контроля = 0, 40
нижний предел неопределенного диапазона = 0, 40 × 0, 750 = 0, 30
неопределенный диапазон в данном примере будет 0, 30-0, 39
образцы ≥ 0, 40 считаются положительными.
iii) Тестовые образцы являются отрицательными, если значение их чистой абсорбции ниже нижнего предела “неопределнного” диапазона (< 0, 30 в примере).
2. 2. Иммунодиффузия в агаровом геле (тест, предписанный для международной торговли)
Иммунодиффузия в агаровом геле (AGID) – специфический, но не очень чувствительный тест, который проводят с целью обнаружения антител в образцах сыворотки, полученных от отдельных животных. Данный метод не подходит для исследования молока (за исключением первых колострумов) по причине недостаточной специфичности и чувствительности. Иммунодиффузию в агаровом геле легко проводить, и данный метод является чрезвычайно полезным и эффективным при реализации схем искоренения. Референтные сыворотки включены в коммерческие наборы для AGID.
2. 2. 1. Агаровый гель
В 0, 2М Tris буфере, рН 7. 2, готовят 0, 8-1, 2% раствор агара или агарозы с 8, 5% NaCl. Одним из способов приготовления агара является растворение 24, 23 г Tris метиалима в 1 литре дистиллированной воды и доведения до рН 7, 2 с 2, 5М HCl. Хлористый натрий (85 г) растворяют в 250 мл Tris/HCl и доводят до 1 литра. Добавляют агарозу (8 г) и нагревают смесь в варочном автоклаве в режиме 4, 55 кг/см2 в течение 10 минут. Смесь делят на аликвоты по 15 мл, которые затем хранят при температуре 4º С в течение 6 недель.
|
|
|
