 |
Номенклатура и объем исследований
|
|
|
|
В медицинских организациях производят отбор, хранение и транспортировку проб биологического материала от больных ЛЗН, лиц с подозрением на нее, реконвалесцентов и секционного материала при летальном исходе.
В медицинских организациях проводят иммунологические исследования клинического материала от больных ЛЗН, лиц с подозрением на нее и реконвалесцентов с целью обнаружения в крови и СМЖ специфических антител (IgM и/или IgG, при обнаружении IgG – определение индекса авидности) и антигенов к ВЗН. При наличии соответствующих лабораторий и оборудования в медицинских организациях проводят молекулярно-генетические исследования (выявление РНК вируса ЗН).
5.1.3. Порядок работы при отборе материала для исследования на лихорадку Западного Нила в медицинских организациях
Требования к отбору и транспортировке проб клинического материала
Забор материала от больных ЛЗН, лиц с подозрением на нее, реконвалесцентов, а также секционного материала, осуществляет медицинский персонал с соблюдением требований режима биологической безопасности (во избежание внутрибольничного заражения) в соответствии с требованиями санитарных правил по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности.
Забор секционного материала при вскрытии умерших от ЛЗН, а также с подозрением на данную инфекцию проводит патологоанатом или судмедэксперт в присутствии специалиста по особо опасным инфекциям.
По окончании манипуляций лабораторный инвентарь и расходные материалы немедленно после применения подлежат обязательному обеззараживанию.
Транспортировку материала осуществляют в соответствии с требованиями санитарных правил по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.
|
|
|
Забор материала для иммунологической диагностики
Материалом для иммунологического исследования является сыворотка крови и спинномозговая жидкость больного или реконвалесцента.
Кровь для иммунологического исследования забирают дважды – при поступлении больного с подозрением на ЛЗН, а также на 10 - 14 день после первого забора крови.
Кровь у больного берут натощак из локтевой вены в количестве 5-10 мл, соблюдая правила асептики, шприцем или с использованием вакуумной системы типа «Vakuettе®» с активатором сыворотки. Для предотвращения гемолиза, после образования сгустка сыворотку следует отобрать. Полученную сыворотку переносят в пластиковую пробирку с плотно закрывающейся (завинчивающейся) пробкой. Пробирку маркируют. Сгусток сохраняют в пробирке только при первом взятии крови. Он может быть использован для вирусологического исследования.
На каждую пробу заполняют направление (приложение 5, 6).
Забор материала для вирусологических исследований
Материалом для выделения вируса ЛЗН является: цельная кровь, плазма, сгусток крови, секционный материал (головной мозг, печень, селезенка, почки).
Материал от больных для вирусологических исследований забирают в ранние сроки от начала заболевания (до 5 дня), то есть в период вирусемии. При нормализации температуры тела возможность выделения вируса резко снижается, а при появлении в крови вирусспецифических иммуноглобулинов класса G (10-14 день от начала болезни) становится невозможной.
Забор секционного материала необходимо производить как можно быстрее после смерти больного (не позднее 20 часов, если труп находится при комнатной температуре). Отбор проб проводят из нескольких участков, подвергшихся изменениям, и из участка рядом расположенной ткани, которая выглядит неизмененной. При наличии распада ткани основное внимание обращают на пограничную зону. Забранный материал помещают в стерильные контейнеры (емкости) с плотно закрывающимися (завинчивающимися) крышками, контейнеры маркируют. На каждую пробу заполняют направление (приложение 7).
|
|
|
Для вирусологического исследования не допустимо внесение в пробы консерванта и проведение инактивации материала.
Забор материала для молекулярно-генетического исследования
Забор материала осуществляют в соответствии с требованиями действующих методических указаний по организации работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности.
Материалом для исследования служат образцы цельной крови, сыворотки и/или плазмы крови, лейкоцитарная фракция крови, СМЖ и пробы секционного материала. Для проведения ОТ-ПЦР забор плазмы крови и спинномозговой жидкости проводят в ранние сроки болезни (в период вирусемии), не позднее 12 дня от начала заболевания. При взятии крови для исследования методом ПЦР следует использовать специальную вакуумную систему типа «Vakuettе®» с ЭДТА.
Хранение проб
Плазму и сыворотку крови хранят при температуре от 2 оC до 8 оC не более 2 сут., при температуре от минус 16 оC до 20 оC не более одного месяца, при температуре минус 70 оC или в жидком азоте в течение 1 года, не допуская его оттаивания до проведения исследования.
Образцы тканей хранят при температуре минус 70 0C или в жидком азоте в течение 1 года.
Транспортировка крови, сывороток и секционного материала в лабораторию
Доставку в лабораторию материала для исследования осуществляют в герметичных контейнерах. При доставке проб в биксах или в сумках-холодильниках, пробы должны иметь вторичную упаковку. Доставляемые емкости с жидкими материалами должны быть закрыты пробками, исключающими выливание содержимого во время транспортирования. Дно контейнеров, содержащих емкости с ПБА, должно быть покрыто адсорбирующим материалом (марлевая салфетка, ткань, вата и пр.), смоченным дезинфицирующим средством.
При замораживании клинического материала его транспортировка также должна проводиться в замороженном состоянии. Допускается только однократное замораживание-оттаивание образцов.
|
|
|
Цельная кровь замораживанию не подлежит. Необходимо отделить сыворотку крови от сгустка.
Материал для вирусологического исследования следует транспортировать в лабораторию в сосудах Дьюара с жидким азотом или в емкости с сухим льдом. Если время доставки материала для вирусологических исследований в лабораторию не превышает 4 ч, то возможно использование термоконтейнера с хладагентами.
Материал с направлением доставляют в лабораторию специально выделенным транспортом в сопровождении медицинского работника.
5.1.4.Оформление направления на исследование
На каждую отправляемую в лабораторию пробу от больного ЛЗН или с подозрением на эту инфекцию заполняют направление в соответствии с приложением 5, 6. На пробы секционного материала (от умершего от ЛЗН или с подозрением на эту инфекцию) заполняют направление в соответствии с приложением 7. При передаче материала для исследования в стороннюю организацию оформляют сопроводительный документ, в котором указывают адрес учреждения, в которое направляется проба (пробы); вид материала, взятого для исследования; количество образцов, цель исследования; наименование учреждения, должность, фамилия и инициалы лица, направляющего пробу (пробы), подпись.
5.1.5. Проведение иммунодиагностических исследований клинического материала на лихорадку Западного Нила в медицинских организациях
В лаборатории медицинской организации с целью лабораторного подтверждения диагноза ЛЗН проводят определение антител классов М и G к ВЗН в СМЖ и парных сыворотках крови. Возможно определение авидности IgG.
Для диагностики используют тест-системы, зарегистрированные в Российской Федерации. Выявление специфических антител класса M (IgM) и класса G (IgG) осуществляется с помощью иммуноферментных тест-систем в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями.
Клинический диагноз ЛЗН считают подтвержденным:
-при обнаружении в исследуемых образцах специфического фрагмента РНК вируса ЛЗН;
- при выявлении в ИФА IgM в одной сыворотке в титре, равном или выше диагностического (в зависимости от рекомендаций фирмы-производителя иммунодиагностической тест-системы, зарегистрированной в Российской Федерации);
|
|
|
- при 4-кратном увеличении титра IgG к ВЗН, при одновременном исследовании парных сывороток крови и при условии отрицательного результата на другие эндемичные флавивирусы.
При оценке результатов иммунологического исследования необходимо учитывать, что IgM в спинномозговой жидкости появляются на 1-3 сутки от начала клинических проявлений болезни, а в сыворотке крови - на 2-3 дня позже (при тяжелых формах течения болезни). При легком течении ЛЗН IgM в сыворотке крови определяют с 3-5 дня болезни. Имеются данные о длительной циркуляции IgM (12-16 месяцев).
Следует помнить, что в начальной фазе заболевания титры IgG могут быть низкие, или результат исследования на наличие антител класса G – негативный.
Если при анализе парных сывороток на антитела класса G образец, взятый в острую фазу заболевания, негативный, а образец, взятый в фазу реконвалесценции, позитивный, то имеет место сероконверсия, что свидетельствует о первичной инфекции.
Одной из важных особенностей вирусов семейства Flaviviridae является наличие выраженных антигенных связей между его представителями, в том числе между вирусами серокомплекса КЭ, а также других арбовирусных инфекций. Широкое распространение КЭ и увеличение ареала распространения ЛЗН делает проблему дифференциальной диагностики данных инфекций весьма актуальной.
На эндемичных территориях по ЛЗН при отсутствии циркуляции вируса КЭ или других флавивирусов достаточно проведения исследований на выявление антител лишь для ВЗН.
Однако, на эндемичных территориях по КЭ или другим флавивирусным инфекциям (при подозрении на ЛЗН), для подтверждения острой формы инфекций необходимо проведение сравнительных исследований на выявление антител класса IgM к другим флавивирусам, причем в парных сыворотках. Тестирование на IgG является косвенно подтверждающим диагноз исследованием, так как положительные результаты часто регистрируются при других флавивирусных инфекциях, являясь отражением перекрестных реакций.
Измерение авидности специфичных к ВЗН IgG позволяет определить период времени, прошедший после первичного инфицирования. Так, IgG, выявляемые в первые 3-5 месяцев после первичного инфицирования, имеют низкую авидность, в то время как в более поздние сроки IgG показывают высокую авидность.
При индексе авидности (ИА) менее 50%, сыворотка содержит низкоавидные антитела, что указывает на текущую, либо недавно перенесенную инфекцию (2-3 месяца назад). Если индекс авидности более 70%, то сыворотка содержит высокоавидные антитела, что указывает на перенесенную ранее инфекцию.
|
|
|
В то же время высокое значение ИА анализируемой пробы к антигенам ВЗН не позволяет установить время начала заболевания ЛЗН, тогда как аналогичная величина ИА к антигенам ВКЭ указывает на перенесенный ранее (более 80 дней) КЭ. Однако при клещевом энцефалите могут обнаруживаться IgG-антитела к ВЗН с высокой авидностью (до 100 %).
Таким образом, наличие IgM свидетельствует об острой, либо недавно перенесенной инфекции, обусловленной ВЗН. Выявление антител класса IgG необходимо использовать в парных сыворотках в качестве подтверждающего теста и при проведении сероэпидемиологических исследований.
Результаты лабораторных анализов оформляют в соответствии с приложением 8 МУ.
|
|
|
