Биолюминесцентной АТФ-метрии

ВВЕДЕНИЕ

Классические микробиологические или прямые методы детекции микробных клеток основаны на посеве разведений образца на агаризованную питательную среду с последующим инкубированием в течение нескольких часов или суток. Ввиду большой продолжительности, трудоемкости, недостаточной точности и объективности прямые методы детекции микробных клеток не могут быть использованы для экспресс-контроля в клинической и санитарной микробиологии, в биотехнологических процессах. Для этих целей обычно используют косвенные методы детекции микробных клеток - так называемые методы «быстрой микробиологии». Эти методы основаны на определении какого-либо физико-химического параметра анализируемого образца, абсолютная величина которого или её изменение пропорциональны количеству присутствующих в образце микробных клеток. По экспериментальным данным, полученным прямым и косвенным методами, задают корреляционную зависимость (в виде таблицы, графика, уравнения линейной или полиномиальной регрессии), при помощи которой в дальнейшем определяют количество микробных клеток в образце.

Методы детекции микробных клеток по содержанию различных внутриклеточных или внеклеточных метаболитов представляют наибольший интерес, так как отличаются повышенной чувствительностью, воспроизводимостью и экономичностью. В литературе описано количественное определение микробных клеток в различных образцах по содержанию таких метаболитов, как: пирувата, лактата, эндотоксина, нуклеиновых кислот (гибридизационные тесты), различных антигенов (иммуноферментный анализ), внутриклеточного АТФ (биолюминесцентный метод) и т.д. Биолюминесцентный метод занимает особое место среди выше перечисленных, так как позволяет определять только жизнеспособные клетки в образце с низким пределом обнаружения.

1.1. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ АТФ КАК ИНДИКАТОР ПРИСУТСТВИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК В РАЗЛИЧНЫХ ОБРАЗЦАХ

АТФ - метаболит, содержащийся в клетках любых живых организмов - от самых примитивных представителей царства протистов (цианобактерий) до высших организмов, включая человека. Поэтому его можно рассматривать как универсальный индикатор присутствия жизнеспособных клеток (животных, растительных, микробных) в анализируемом образце. При гибели клетки содержание АТФ, в отличие от других метаболитов, используемых для детекции клеток, резко снижается в течение нескольких секунд.

Содержание АТФ в клетках различных микроорганизмов (бактерий, одноклеточных водорослей, грибов) относительно высоко и постоянно в стационарном состоянии. По литературным данным содержание АТФ составляет:

В зависимости от возраста, фазы роста, состава питательной среды и метаболической активности содержание внутриклеточного АТФ несколько меняется, но в менее широком диапазоне, чем содержание других метаболитов. Кроме того, клетки некоторых микроорганизмов данные метаболиты вообще не продуцируют.

1.2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТФ

АТФ можно определять при помощи ЯМР-спектроскопии, хроматографии, ферментативными, и наконец, биолюминесцентным методом.

Биолюминесцентный метод определения АТФ основан на таком явлении как биолюминесценция - свечение, возникающее при реакции окисления органического субстрата, люциферина, кислородом воздуха в присутствии АТФ и ионов Mg под действием фермента люциферазы светляков согласно схеме:

+ АТФ+ О₂+Mg²⁺

+ АМФ + ФФi + СО2 + hn,

где: ФФi - пирофосфат, hn - испускаемый в ходе реакции квант света.

Возможность использования данной ферментативной реакции в аналитических целях для количественного определения внутриклеточного АТФ в анализируемых образцах обусловлена: 1) практически абсолютной специфичностью люциферазы светляков как по отношению к D-люциферину, так и к АТФ; 2) квантовым выходом реакции близким к 1 - т.е. квант света выделяется при образовании каждой молекулы оксилюциферина; 3) пропорциональной зависимостью интенсивности свечения от концентрации АТФ

Существенными достоинствами биолюминесцентного метода определения АТФ являются:

высокая чувствительность. Метод позволяет определять ультрамалые количества АТФ, на уровне 10^-14 моль в кювете люминометра, что соответствует 10³ё10⁴ бактериальных клеток. При использовании специальной методики подготовки образцов и сверхчувствительных люминометров предел обнаружения АТФ может достигать 10^-16 моль в кювете люминометра, т.е. метод позволяет определять 10ё100 бактериальных клеток. Для сравнения: предел обнаружения клеток микроорганизмов импедиметрическим методом составляет 10⁶ё10⁷ кл./мл по содержанию белка или ДНК в образце - 10⁵ клеток. Чувствительности радиоизотопного и биолюминесцентного методов сопоставимы, но в настоящее время радиоизотопные методы имеют ограниченное практическое применение в связи с их повышенной опасностью для здоровья человека.

простота исполнения и повышенная производительность. В зависимости от природы образца время его подготовки для измерения АТФ варьирует от 1 минуты до нескольких часов, а само измерение занимает не более 1 минуты.

экономичность. В настоящее время многими фирмами производятся коммерчески доступные АТФ-реагенты на основе люциферазы светляков с постоянным в течение нескольких десятков секунд или минут уровнем биолюминесцентного сигнала и приборы для детекции биолюминесценции - люминометры, как сверхчувствительные стационарные, так и портативные для работы в полевых условиях.

1.3. Основные области применения "быстрой микробиологии"-

биолюминесцентной АТФ-метрии