 |
Обнаружение и контроль микробных загрязнений
|
|
|
|
Медицина. Обнаружение микробных инфекций в крови, моче и других биологических образцах. Быстрый подбор антибиотика, определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.
Ветеринария. Определение количества соматических клеток в молоке - наиболее простой и быстрый способ диагностики мастита.
Пищевая, фармацевтическая, парфюмерная промышленность. Экспресс-анализ уровня микробных загрязнений для контроля качества на всех этапах производства - от исходного сырья до готовой продукции. Микробиологическая чистота мясо-молочных продуктов, соков и напитков, лекарств и косметики - основное условие их длительной сохранности и высоких потребительских качеств.
Промышленность. Подбор биоцидов и штаммов-биодеструкторов для разрушения отходов.
Экология. Контроль стерильности в особо чистых помещениях медицинских и промышленных учреждений.
Оценка жизнеспособности живых клеток
Медицина. Контроль жизнеспособности спермы, качества донорских материалов и органов при трансплантации.
Ветеринария. Оценка жизнеспособности семенного материала и эффективности криопротекторов при его консервации, качества вакцинных препаратов.
Биотехнология. Определение активности штаммов-продуцентов.
Экспериментальная часть
Определение общей загрязненности водного раствора
по концентрации АТФ
Определение общей загрязненности водного раствора по количеству АТФ биолюминесцентным методом проводят с помощью реагентов фирмы Люмтек.
Реагенты и оборудование
Реагенты
Флакон № 1 АТФ-реагент - лиофилизованный раствор, содержащий фермент - люциферазу светляков, D-люциферин, сульфат магния, компоненты буферной смеси и стабилизаторы, т.е. все компоненты, необходимые для биолюминесцентной реакции, кроме АТФ.
|
|
|
.
* Лиофилизация (от др.-греч. λύω — растворяю и φιλέω — люблю) — способ мягкой сушки веществ, при котором высушиваемый раствор замораживается, а потом помещается в вакуумную камеру, где и происходит возгонка растворителя из замороженного раствора, т е при низкой температуре.
Флакон № 2 - Раствор для реконструкции АТФ-реагента, содержит 5 мл стерильной высокоочищенной воды
Флакон № 3 - АТФ-контроль, содержит 1 мл лиофилизованного раствора АТФ с концентрацией 10 наномоль/л.
ВНИМАНИЕ: При проведении измерений необходимо использовать стерильные наконечники для пипеток и стерильные кюветы для люминометра. Для каждой операции использовать новый наконечник.
Приборы и принадлежности
Прибор для измерения интенсивности биолюминесцентного сигнала – люминометр ЛЮМ-1
Автоматические дозаторы на 0,05; 0,2; 1 и 2 мл
Наконечники для дозаторов
Пробирки стерильные объемом 1,5 мл (типа «эппендорф») в штативе
Микрокюветы полистирольные
Пинцет
Проведение анализа
Подготовка реагентов к анализу
1. Во флакон №1 с лиофилизованным АТФ-реагентом внести определенный объем стерильной воды из флакона №2, выдержать 30 мин перед использованием. Полученный раствор АТФ-реагента можно хранить при комнатной температуре в течение рабочего дня, а при 4оС – в течение 2-3 дней.
2. Во флакон №3 внести 1 мл стерильной воды из флакона №2. Полученный раствор АТФ-контроля с концентрацией АТФ 10 наномоль/л нужно хранить на холоду и использовать в течение одного рабочего дня.
Построение градуировочной зависимости интенсивности биолюминесцентного сигнала от концентрации АТФ
3. Приготовить разведения раствора АТФ-контроля в 2, 4, 8, 16 и 32 раза, чтобы получить растворы АТФ с концентрацией 5; 2,5; 1,25; 0,625 и 0,312 наномоль/л. Для этого пробирки пронумеровать по количеству анализируемых проб, установить в штатив, и внести в пробирки №№ 2 – 7 по 0,2 мл дистиллированной воды из флакона №2.
|
|
|
Затем из пробирки №1 внести в пробирку №2 0,2 мл раствора АТФ №1, тщательно перемешать. Аналогично приготовить растворы №№ 3-6, внося в пробирки по 0,2 мл соответствующего раствора АТФ.
Таблица для регистрации экспериментальных данных
| № Раст-вора АТФ | Раствор АТФ, мл | Вода из флакона № 2, мл | Концентрация АТФ в полученном растворе, наномоль/л | Концентрация АТФ в кювете, наномоль/л | Значения биолюминесцентно-го сигнала для данного раствора АТФ, (I) |
| №1 | Исходный раствор АТФ-контроля | - | 10,0 | ||
| №2 | 0,2 мл р-ра №1 | 0,2 мл | 5,0 | ||
| №3 | 0,2 мл р-ра №2 | 0,2 мл | 2,5 | ||
| №4 | 0,2 мл р-ра №3 | 0,2 мл | 1,25 | ||
| №5 | 0,2 мл р-ра №4 | 0,2 мл | 0,625 | ||
| № 6 | 0,2 мл р-ра №5 | 0,2 мл | 0,312 | ||
| № 7 | Фоновый сигнал | 0,2 мл | фон |
4. Внести в микрокювету с помощью автоматических дозаторов:
- 0,05 мл раствора АТФ, полученного по пункту 3;
- 0,05 мл раствора АТФ-реагента из флакона №1.
Быстро перемешать содержимое микрокюветы, прокачав его 2-3 раза через наконечник дозатора. Поместить микрокюветус помощью пинцета в кюветное отделение люминометра иизмеритьбиолюминесцентныйсигнал на люминометре (I)
6. Повторить измерения по пункту 4для той же концентрации АТФ, найти среднее значение, провести аналогичные измерения для растворов №2- №7, по два измерения для каждой точки, и построить градуировочную зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации АТФ.
7. Составить уравнение, описывающее градуировочную зависимость типа:
I = A + B [АТФ], уравнение (1)
Где I – интенсивность биолюминесцентного сигнала в относительных световых единицах,
[АТФ] – концентрация АТФ в кювете, наномоль/л,
A и B - коэффициенты уравнения (1)
|
|
|
