Определение состава фосфатидилхолина

Идентификация холина. При кипячении лецитина в растворе гидроксида натрия ощущается запах селедочного рассола, характерный для триметиламина (N[CH₃]₃), который образуется из холина при нагревании. Триметиламин обнаруживается также по посинению (щелочная реакция) влажной лакмусовой бумажки, если ее подержать над кипящим раствором.

Идентификация жирных кислот. Натриевые соли жирных кислот (растворимы в воде) в кислой среде, например при подкислении ее соляной кислотой, переходят в свободные жирные кислоты (нерастворимые в воде), всплывающие на поверхность раствора.

Идентификация глицерина. Используется акролеиновая проба, уже рассмотренная в предыдущей лабораторной работе.

Идентификация фосфора. Обнаружение фосфорной кислоты в фосфолипидах можно осуществить с использованием молибдата аммония или магнезиальной смеси.

 

1. Фосфорная кислота образует с молибденовым реактивом желтый кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония:

H₃PO₄ + 12 (NH₄)₂MoO₄ + 21 HNO₃ →
(NH₄)₃PO₄ × 12 MoO₃ + 21 NH₄NO₃ + 12 H₂O

 

2. Реакция с магнезиальной смесью основана на образовании кристаллического осадка фосфата магний-аммония MgNH₄PO₄ в ходе двух последовательных реакций: образования фосфата аммония (при подкислении образца аммиаком) и взаимодействия данной соли со смесью хлорида магния и хлорида аммония.

Контрольные вопросы

1. Строение и свойства глицерофосфолипидов. Фосфатидная кислота.

2. Строение и свойства фосфатидилхолина (лецитина) и фосфатидил­этанол­амина (кефалина).

3. Строение и свойства фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола и кардио­липина. Лизофосфолипиды.

4. Строение и свойства сфингофосфолипиидов. Сфингомиелины. Сфингозин и ди­гид­росфингозин. Церамиды.

5. Строение и свойства гликолипидов. Биологическая роль гликолипидов.

6. Строение и свойства цереброзидов и сульфатидов.

7. Строение и свойства ганглиозидов.

8. Определение состава и свойств фосфолипидов.

9. Опыт по выделению лецитина из яичного желтка.

Литература

1. Страйер Л. Биохимия, т. 1, 2, 3. – М.: Мир, 1985.

2. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.: Просвещение, 1987.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека,
т. 1, 2. – М.: Мир, 1993.

4. Горячковский А.М. Справочное пособие по клинической биохимии. – Одесса: ОКФА, 1994.

5. Евстигнеева Р.П., Серебренникова Г.А., Звонкова Е.Н., Филиппович Е.И., Митрофанова Т.К., Мягкова Г.И., Скляр Ю.Е. Химия биологически активных природных соединений / Под ред. Преображенского Н.А. – М.: Химия, 1976.

6. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. – М.: Высшая школа, 1998.

7. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000.

8. Зайчик А.Щ., Чурилов Л.П. Основы патохимии. – СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2000.

9. Чиркин А.А. Практикум по биохимии. – Мн.: Новое знание, 2002.

Ход работы

Тема: Фосфолипиды

 

w Выделение лецитина (фосфатидилхолина) из яичного желтка

1. Желток вареного яйца тщательно растирают в ступке с добав­ле­нием 40 мл эфира.

 

Примечание: Осторожно! Следует удостовериться в отсутст ­ вии в кабинете работающих горелок и других источников открытого пламени.

 

2. Полученный экстракт фильтруют с использованием складчатого фильтра.

3. Для полноты экстракции остаток желтка в ступке дважды промывают порциями эфира по 5 мл, сливая их на фильтр.

4. Фильтрат переносят в фарфоровую чашку и выпаривают досуха на водяной бане.

 

Примечание: Осторожно! Следует работать в вытяжном шкафу. Горелку не использовать.

 

5. Полученный сухой остаток, содержащий смесь фосфолипидов и жиров, тщательно обрабатывают дважды кипящим этиловым спиртом отдельными порциями по 8 мл.

6. Спиртовые вытяжки охлаждают и фильтруют через сухой фильтр в фарфоровую чашку для отделения жиров. Триацилглицеролы, в отличие от лецитина, плохо растворяются в холодном этиловом
спирте.

 

Примечание: Фильтрат должен быть прозрачным.

 

7. Аликвоту прозрачного фильтрата в объеме 2 мл переносят в отдельную пробирку.

8. Этиловый спирт из оставшегося фильтрата выпаривают на водяной бане и получают «сырой» (неочищенный) лецитин.

9. Полученные таким образом препарат лецитина (п. 8) и его спиртовой раствор (п.7) используют в дальнейших опытах.

Тема: Физико-химические свойства фосфолипидов

w Осаждение фосфолипидов ацетоном

1. Третью часть полученного лецитина (по массе) снова растворяют в 3 мл эфира.

2. К полученному раствору при помешивании добавляют 10 мл ацетона.

3. После осаждения лецитина ацетоном надосадочную жидкость осторожно сливают.

4. Взвесь осадка лецитина (3 капли) переносят на предметное стекло, дают ацетону испариться, наносят на то же место еще 3 капли и после испарения ацетона добавляют каплю воды.

5. С помощью микроскопа наблюдают образование на покровном стекле «миелиновых» фигур в виде длинных закрученных нитей с утолщениями на концах.

6. Объясняют полученный результат и делают выводы.

w Эмульгирование фосфолипидов

1. К 2 мл спиртового раствора лецитина добавляют по каплям воду и смесь сильно встряхивают.

2. Объясняют полученный результат и делают выводы.

w Осаждение лецитина (фосфатидилхолина) хлористым кад­мием

1. К 2 мл спиртового раствора лецитина добавляют 1 мл насыщенного спиртового раствора хлористого кадмия и смесь сильно встряхивают.

2. Объясняют полученный результат и делают выводы.

Тема: Изучение химического состава фосфолипидов

 

w Гидролиз фосфолипидов (лецитина)

1. Остаток лецитина переносят в пробирку и добавляют 5 мл 10%‑ного раствора гидроксида натрия.

2. Лецитин гидролизуют (получая смесь холина, жирных кислот, глицерина и фосфорной кислоты) кипячением в течение 10 мин.

w Обнаружение холина

1. Отмечают появление запаха селедочного рассола при гидролизе лецитина.

2. Отмечают изменение цвета влажной лакмусовой бумажки, если ее подержать над кипящей смесью.

3. Объясняют полученный результат и делают выводы.

 

w Обнаружение жирных кислот

1. В гидролизат фосфатидилхолина вносят 10%-ный раствор соляной кислоты до покраснения лакмусовой бумажки (кислая среда).

2. Всплывшие на поверхность жирные кислоты отфильтровывают (фильтрат используют в следующем опыте).

3. Объясняют полученный результат и делают выводы.

 

w Обнаружение глицерина

1. К фильтрату (см. предыдущую стадию) по каплям добавляют
10%-ный раствор гидроксида натрия до нейтральной по лакмусу реакции.

2. Затем фильтрат выпаривают досуха на водяной бане.

3. Присутствие в остатке (берут 1/3 остатка по массе) глицерина определяют с использованием акролеиновой пробы (см. лабо­ра­тор­ную работу №10).

4. Объясняют полученный результат и делают выводы.

 

w Открытие фосфора

Приготовление образца:

1. Оставшуюся часть сухого остатка, полученного на предыдущей стадии эксперимента, переносят в фарфоровый тигель и тщательно смешивают с трехкратным количеством смеси, содержащей 2 части карбоната натрия и 1 часть нитрата калия.

2. Тигель прикрывают крышкой и осторожно нагревают.

 

Примечание: Осторожно! Реакция идет бурно, иногда сопровождается небольшой вспышкой!

 

3. Полученный сплав осторожно прокаливают до полного окисления. После этого тигель охлаждают.

4. Полученную серовато-бурую золу растворяют в 10%-ном растворе азотной кислоты (кислоту добавляют по каплям, растирая золу стеклянной палочкой).

5. С полученным раствором проводят реакции на обнаружение фосфорной кислоты.

 

w Реакция обнаружения фосфорной кислоты с молибдатом аммония

1. К 2 мл молибденового реактива (раствора молибдата аммония в азотной кислоте) добавляют 1 мл анализируемого раствора.

2. Смесь нагревают до кипения и кипятят 2-3 мин.

3. Записывают и объясняют результаты.

 

w Реакция обнаружения фосфорной кислоты с магнезиальной смесью

1. К 1 мл анализируемого раствора постепенно добавляют концент­ри­ро­ванный раствор аммиака до появления резкого запаха.

2. Затем приливают равный объем магнезиальной смеси.

3. Растирают стеклянной палочкой.

4. Записывают и объясняют результаты.

 

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретические данные по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Описать результаты.

4. Сделать выводы.

 

Лабораторная работа № 12

Тема:	1. Выделение нуклеопротеидов. Качественные реакции на присутствие компонентов нуклеопротеидов в растворе 2. Количественное определение нуклеиновых кислот
Цель работы:	Изучение и овладение методами идентификации и количественного определения нуклеиновых кислот в биологических препаратах

Оборудование и материалы:

· Спектрофотометр SOLAR

· Кюветы полистирольные

· Центрифуга К-24

· Весы центрифужные

· Пробирки центрифужные

· Водяная баня

· Плитка электрическая

· Колба круглодонная с обратным холодильником

· Ступка с пестиком

· Воронка стеклянная для фильтрации

· Пипетки стеклянные на 1 и 5 мл

· Микропипетки автоматические

· Пробирки химические

· Штативы для пробирок

· Цилиндры мерные на 50-250 мл

· Стеклянные палочки

· Фильтр бумажный

 

Реактивы:

· Дрожжи

· Эфир

· Песок

· NaOH, 0,4%-ный и 10%-ный растворы

· CH₃COOH, 5%-ный раствор

· H₂SO₄(конц.)

· H₂SO₄, 5%-ный раствор

· CuSO₄, 2%-ный раствор

· NH₄OH (конц.)

· Ag₂О, 1%-ный раствор в NH₄OH

· Тимол, 1%-ный спиртовой раствор

· Молибденовый реактив: молибдат аммония ([NH₄]₂MoO₄),
15%-ный раствор/HNO₃ (конц.) в cоотношении 110 / 90

· Реагенты для орцинового метода:

Раствор А. Орцин, 1%-ный раствор

Раствор Б. HCl(конц.)

Раствор В. FeCl₃ × 6H₂O, 10%-ный раствор

· Дифениламиновый реагент: дифениламин, 1,5%-ный раствор в CH₃COOH; H₂SO₄(конц.); CH₃CHO

· HСlO₄(конц.)

· РНК, стандартный раствор (100mг/мл)

· ДНК, стандартный раствор (50mг/мл)

· вода дистиллированная

Теоретическая часть

Нуклеиновые кислоты

Нуклеиновые кислоты в той или иной степени были известны исследователям достаточно давно. Например, в 1847 г. немецкий химик Ю. Либих, иностранный член-корреспондент Петербургской академии наук, впервые выделил из мясного экстракта инозиновую кислоту (монофосфорный эфир нуклеозида инозина). В 1869 г. швейцарский врач Ф. Мишер, исследуя химический состав ядер лейкоцитов, выделил из них вещество, обладавшее кислыми свойствами, которое он назвал нуклеином. Это событие расценивают как открытие нуклеиновых кислот, хотя сам термин «нуклеиновая кислота» был введен лишь 30 лет спустя, в 1899 г. Немногим ранее, в 1891 г., немецкий биохимик Альбрехт Кëссель осуществил и описал гидролиз нуклеиновой кислоты и показал, что она состоит из остатков сахара, фосфорной кислоты и четырех гетероциклических оснований, являющихся производными пурина и пиримидина. Он же впервые доказал существование двух типов нуклеиновых кислот.

С начала XX в. началось интенсивное изучение продуктов расщепления нуклеиновых кислот. Большой вклад в химию пуринов и пиримидинов внес химик-органик Э. Фишер, а позднее в работах Ф. Левена и Д. Гулланда было дано описание строения углеводных компонентов и определена природа нуклеозидных звеньев в составе нуклеиновых кислот. Используемые и в настоящее время термины нуклеозид и нуклеотид были предложены Ф. Левеном еще в 1908–1909 гг. Окончательно химическое строение нуклеозидов и нуклеотидов, а также роль фосфодиэфирной связи в полимеризации мономерных звеньев нуклеиновых кислот были выяснены в 1952 г. английскими исследователями под руководством А. Тодда.

После открытия того факта, что нуклеиновые кислоты являются полимерами, состоящими из нуклеотидов четырех типов, с конца 30‑х гг. прошлого столетия утвердилось мнение, что полимер нуклеиновой кислоты представляет собой многократно повторяющиеся тетрануклеотиды, состоящие из всех четырех азотистых оснований. Эта теория, сформулированная Ф. Левеном, была опровергнута в 1950 г. Эрвином Чаргаффом с сотрудниками из Колумбийского университета. Чаргафф установил значительные различия в нуклеотидном составе ДНК из разных источников и сформулировал основные положения, характеризующие состав нуклеиновых кислот, которые получили название правил Чаргаффа.

Вершиной исследований строения нуклеиновых кислот явилась модель двойной спирали ДНК, предложенная в 1953 г. американским биохимиком и генетиком Дж. Уотсоном и английским физиком Ф. Криком. Эта дата официально считается моментом рождения новой отрасли биологической науки – молекулярной биологии. На основании модели ДНК была выдвинута гипотеза полукон ­ сер ­ вативного способа репликации данной молекулы, которая была подтверждена в 1957 г. после открытия Артуром Корнбергом фермента ДНК-поли ­ меразы.

Начало работам, приведшим к выяснению биологической роли РНК, было положено в 30-е гг. Т. Касперсоном и Ж. Браше, которые изучали содержание и распределение в клетке нуклеиновых кислот и, в первую очередь РНК. Значительно позже (в 50-х гг.) было показано, что синтез белка осуществляется рибосомами, но представления о существовании РНК-посредника (иРНК), переносящего инфор­мацию от ДНК к рибосомам, были сформулированы французскими генетиками Ф. Жакобом и Ж. Моно только в 1961 г. Главный фермент транскрипции – ДНК-зависимая-РНК-полимераза – был открыт в 1960 г. С. Вейссом, Ж. Гурвицем и О. Стивенсом.

Таким образом, подводя итог этой краткой исторической справке и принимая во внимание современные представления о структуре и функции нуклеиновых кислот, можно сказать, что нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) являются важнейшими информационными макромолекулами клетки, которые с химической точки зрения представляют собой полимеры, построенные из многих тысяч и даже миллионов нуклеотидов, соединенных между собой 3^/-5^/-фосфодиэфирными связями. В зависимости от вида нуклеиновой кислоты различают дезоксирибонуклеотиды (содержат 2^/- дезокси-D-рибозу и входят в состав ДНК) и рибонуклеотиды (содержат D-рибозу и входят в состав РНК). Кроме того, в зависимости от химической природы азотистых оснований (пуриновые или пиримидиновые), входящих в состав нуклеотидов, их подразделяют на пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды соответственно. Следует иметь в виду, что биологическая роль нуклеотидов не ограничивается их участием в качестве мономеров в процессах биосинтеза ДНК и РНК. В частности, пуриновые рибонуклеотиды выполняют функции универсальных источников энергии (например, АТР и GTP), регуляторных сигналов (сАМР, сGMP), они входят в состав важнейших коферментов (FAD, NAD⁺, NADP⁺) и служат переносчиками метильных групп (S-аденозилметионин); пиримидиновые нуклеотиды функционируют в качестве макроэргических интермедиатов в углеводном обмене (UDP-глюкоза, UDP-галактоза) и в синтезе липидов (CDP-ацилглицерол).

Компоненты нуклеиновых кислот

Структура пиримидиновых и пуриновых оснований

Пиримидиновые и пуриновые азотистые основания, входящие в состав нуклеотидов, представляют собой замещенные производные шестичленного гетероцикла – пиримидина, с одной стороны, и пурина – сложной гетероциклической системы, состоящей из двух конденсированных гетероциклов: пиримидина и имидазола, – с другой стороны (рис. 12.1).

Рис. 12.1. Структурные формулы пиримидина и пурина – исходных соединений пиримидиновых и пуриновых оснований нуклеиновых
кислот

Положения атомов в ароматических кольцах пронумерованы в соответствии с принятой номенклатурой. Следует обратить внимание на то, что нумерация в пиримидиновом и пуриновом кольцах идет в противоположных направлениях, при этом атом углерода С₅ в обеих молекулах находится в одном и том же положении.

⇐ Предыдущая123Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: