 |
История открытия и изучения ферментов. Черты сходства и различия ферментов и катализаторов иной природы.
|
|
|
|
Учение о ферментах выделено в самостоятельную науку – энзимологию. Термин «энзим», так же как «фермент», означает процесс, связанный с выделением газов, брожением.
Явление брожения и переваривания известно с незапамятных времен. Но первое научное представление относится к первой половине XIX века, в 1814 г. петербургский ученый К.С. Кирхгоф показал, что не только проросшие семена ячменя, но и экстракты из солода способны осахаривать крахмал до мальтозы. Это вещество получило название амилазы.
Ю. Либих и Ф. Велер открыли амигдамин, содержащийся в эфирном масле горького миндаля. Затем были открыты другие ферменты: пепсин, трипсин, которые вызывают гидролиз белков в желудочно-кишечном тракте.
Значительный вклад в ферментологию или энзимологию внесли как отечественные ученые, так и зарубежные.
Наибольшее внимание исследователей привлекали процессы окисления в организме. В организме в процессе превращения глюкозы до СО2 и Н2О последовательно участвует около 15 различных ферментов. Биологические катализаторы не вызывают каких-либо побочных реакций.
- Современные направления исследования энзимологии. Исследование молекулярного действия механизма действия и принципы работы ферментов. Разработка теории ферментативного катализа. Изучение ферментов в соответствии с законами классической органической химии.
- Изучение ферментов на более высоких уровнях, но несколько отдельных ферментов, сколько ферментных комплексов сложных систем.
- Исследование механизмов регуляции активности и синтеза ферментов.
- Создание искусственных низкомолекулярных ферментов.
- Исследование в области инженерной энзимологии, создание «гибридных» катализаторов, сочетающих свойства ферментов, антител, рецепторов, ценных для медицины и народного хозяйства.
|
|
|
Черты сходства и различия ферментов и катализаторов иной природы
Сходства
1. Они катализируют только энергетически возможные реакции.
2. Они никогда не изменяют направления реакции.
3. Они не изменяют равновесия обратимой реакции, а лишь ускоряют его наступление.
4. Они не расходуются в процессе реакции. Поэтому фермент в клетке работает до тех пор, пока по каким - либо причинам не разрушится.
Отличия
1. Скорость ферментативного катализа намного выше, чем небиологического. Из этого следует, что ферменты сильнее снижают энергию активации реакции, чем небиологические катализаторы.
2. Ферменты обладают высокой специфичностью. Высокая специфичность позволяет ферментам направлять обмен веществ в строгое русло.
3. Ферменты катализируют химические реакции в «мягких» условиях, т.е. при обычном давлении, невысокой температуре (около 37оС) и рН среды, близком к нейтральной. Это отличает их от других катализаторов, действующих при больших давлениях, крайних значениях рН и высокой температуре.
4. Ферменты являются катализаторами с регулируемой активностью, чего нельзя сказать о небиологических катализаторах. Это уникальное свойство ферментов позволяет изменять скорость превращения веществ в организме в зависимости от условий среды, т.е. приспосабливаться к действию различных факторов.
5. Скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству фермента, тогда как для небиологического катализа не существует строгой зависимости скорости реакции от количества катализатора.
15. Строение ферментов. Методы выделения и очистки ферментов. Методы иммобилизации ферментов
- По строению ферменты делятся:на простые (однокомпонентные) - состоит только из белковой части
- сложные (двухкомпонентные) - белковая и небелковая Иначе сложный фермент называют холоферментом. Белковую часть в его составе называют апоферментом, а небелковую - коферментом.
|
|
|
Химическая природа коферментов была выяснена в 30-е гг. Оказалось, что роль некоторых коферментов играют витамины или вещества, построенные с участием витаминов В1, В2, В5, В6, В12, Н, Q и др. Особенностью сложных ферментов является то, что отдельно апофермент и кофермент не обладают каталитической активностью.
В составе как простого, так и сложного фермента, выделяют:
Каталитический центр простого фермента представляет собой уникальное сочетание нескольких аминокислотных остатков, расположенных на разных участках полипептидной цепи. Образование
каталитического центра происходит одновременно с формированием третичной структуры белковой молекулы фермента. Чаще всего в состав каталитического центра простого фермента входят остатки серина, цистеина, тирозина, гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.
Субстратный центр простого фермента - это участок белковой молекулы фермента, который отвечает за связывание субстрата. Субстратный центр образно называют "якорной площадкой", где субстрат прикрепляется к ферменту за счет различных взаимодействий между определенными боковыми радикалами аминокислотных остатков и соответствующими группами молекулы субстрата. Субстрат с ферментом связывается посредством ионных взаимодействий, водородных связей; иногда субстрат и фермент связываются ковалентно. Гидрофобные взаимодействия также играют определенную роль при связывании субстрата с ферментом. В простых ферментах субстратный центр может совпадать с каталитическим; тогда говорят об активном центре фермента.
Аллостерический центр представляет собой участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому какого-то низкомолекулярного вещества изменяется третичная структура белковой молекулы фермента, что влечет за собой изменение его активности. Аллостерический центр является регуляторным центром фермента.
Методы выделения и очистки ферментов
Долгое время вполне обоснованно считали, что все ферменты - тела белковой природы. Однако в начале 80-х годов была неожиданно открыта способность низкомолекулярных рибонуклеиновых кислот ускорять реакцию превращения предшественников РНК в функционально значимый продукт, т. е. возникло представление о полирибонуклеотидной природе некоторых ферментов, названных рибозимами.
|
|
|
Единственный реальный в настоящее время способ получения ферментов - это выделение их из биологических объектов.Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше -10°С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод выделения и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Одна из модификаций адсорбционного метода - афинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые несут в своем составе многие индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей ферментативной активности. Этому способствует проведение операций в присутствии защитных добавок, в частности HS-содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.):
Очень важно поддерживать на всех этапах выделения ферментов низкую температуру, так как некоторые из них даже при -80°С теряют активность.
Методы иммобилизации ферментов
|
|
|
- Существует 2 принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалент. связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации)
- с образов. ковалент. связи между ними (химические методы иммобилизации).
Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:
- адсорбция на нерастворимых носителях;
- включение в поры геля;
- пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);
- включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.
В отличие от физических методов этот способ химич иммобилиз. обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима.
16. Номенклатура и классификация ферментов . Характеристика оксидоредуктаз
В настоящее время известно более 2400 ферментов. Каждый фермент, как правило, имеет две номенклатуры; одна из них рабочая (тривиальная), а другая - систематическая.
Рабочее наименоваие фермента составляют путем прибавления к корню слова латинского, греческого или химического названия субстрата, на который действует фермент, или к названию процесса, катализируемого данным ферментоа окончания “-аза”. Вещество, имеющее это окончание, принимают за фермент. Ферменты, действующие на крахмал (amylum), сахарозу, мочевину (urea), пептиды получили соответственно названия: амилаза, сахараза, уреаза,пептидаза; ферменты, катализирующие процессы гидролиза называют гидролазами, процессы окисления - оксидазами, перенос групп - трнсферазами и т.д. Для некоторых ферментов сохранены названия, неподчиняющиеся этому правилу: пепсин, трипсин, химотрипсин папин и др.
В названии ряда ферментов указывают как характер субстрата, так и тип катализируемой реакции. Фермент, катализирующий отнятие водорода от спирта, называют алкогольдегирогеназа.
Рабочим названием ферментов пользуются в повседневной практике.
В 1961 г. Международная комиссия по ферментам, созданная в 1956 г., предложила новую схему номенклатуры и классификации ферментов, которая была принята Международным биохимическим союзом. Согласно этой схемы каждый фермент имеет как рекомендуемое (рабочее) название, так и систематическое название, которое составляется в определенном порядке и подчеркивает тип катализируемой реакции (см. классы ферментов).
|
|
|
В принятой классификации все ферменты на основании катализируемых реакций разделены на шесть классов, расположенных в следующем порядке:
1. Оксидоредуктазы катализируют окислительно-восстановительные процессы.
2. Трансферазы катализируют реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков с одной молекулы на другую.
3. Гидролазы катализируют реакции гидролиза.
4. Лиазы катализируют реакции отщепления (кроме атомов водорода) с образованием двойной связи либо присоединения по двойной связи, а также негидролитический распад органических соединений либо синтез без участия макроэргических веществ.
5. Изомеразы катализируют процессы изменения геометрической или пространственной конфигурации молекул.
6. Лигазы катализируют реакции синтеза, сопровождающиеся гидролизом богатой энергией связи (как правило, АТФ).
Каждый класс подразделяется на подклассы, а каждый подкласс - на подподклассы. Индивидуальный фермент имеет кодовое число (шифр) со стоящими перед ним буквами КФ (англ. ЕС). Шифр каждого фермента содержит четыре числа, разделенных точками. Первое число указывает к какому из шести классов принадлежит данный фермент. Второе число обозначает подкласс. Третье число обозначает подподкласс, а четвертое - порядковый номер фермента в данном подподклассе. Например, фермент КФ.1.1.1.1 имеет рекомендуемое (рабочее) название алкогольдегидрогеназа, систематическое название алкоголь:НАД оксидоредуктаза. Этот фермент относится к классу оксидоредуктаз (1), действует на СН-ОН группу доноров (1.1), акцептором водорода служит НАД (1.1.1); четвертая цифра шифра - порядковый номер фермента в пределах подподкласса.
Систематическое название и шифр фермента используют в научных публикациях при первом упоминании о нем; при дальнейшем изложении материала пользуются рекомендуемым (рабочим) названием.
Характеристика оксидоредуктаз
1. Дегидрогеназы – оксидоредуктазы, катализирующие дегидрирование субстрата с использованием в качестве акцептора водорода любых молекул, кроме кислорода.
2. Редуктазы - если перенос водорода от молекулы донора трудно доказуем
3. Оксидазы – оксидоредуктазы, катализирующие окисление субстратов с молекулярным кислородом в качестве акцептора электронов без включения кислорода в молекулу субстрата.
4. Монооксигеназы – оксидоредуктазы, катализирующие внедрение одного атома кислорода в молекулу субстрата с молекулярным кислородом в качестве донора кислорода.
5. Диоксигеназы – оксидоредуктазы, катализирующие внедрение 2 атомов кислорода в молекулу субстрата с молекулярным кислородом в качестве донора кислорода.
6. Пероксидазы – оксидоредуктазы, катализирующие реакции с пероксидом водорода в качестве акцептора электронов.
|
|
|
