Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК).

ЭСК официально пока не используются в клинической медицине из-за морально-этических и правовых проблем, связанных с прекращением развития человеческих зародышей, а также опасности перерождения отдельных популяций этих клеток в злокачественные тератокарциномные опухоли после трансплантации во взрослый организм (25-30% наблюдений по Odorico et al. [64]). Однако, несмотря на это, в ведущих медицинских центрах мира уже более 5 лет не прекращаются интенсивные научные исследования условий выращивания бессмертных линий ЭСК и их направленной дифференцировки в различные типы соматических клеток, так как технологическая возможность осуществления ген-индуцированной селекции этих клеток делает ЭСК уникальным потенциальным источником сырья для получения промышленных объемов высокоэффективных очищенных стандартизированных клеточных препаратов. Другими словами, ЭСК представляют собой новый мощный биоресурс медицины.

Для получения лабораторных линий дифференцированных соматических клеток обычно используют 3 природных источника ЭСК: бластоцисты человека (4-6 дней гестации), половой зачаток фетусов 4-5- недель развития, а также клетки зародыша на стадии гаструляции (8-12 дней гестации), которые еще поддаются репрограммированию в линии ЭСК.

Однако основным источником сырья для получения клонов ЭСК остаются бластоцисты человека после искусственного оплодотворения яйцеклетки в условиях in vitro. Принято считать, что зародыш на стадии бластоцисты представляет собой "стволовую нишу", в которой четко разделены эмбриобласт и поддерживающие его клетки трофобласта, выполняющие роль своеобразного фидера. Клетки трофобласта вырабатывают кофакторы выживания и защиты, которые необходимы для сохранения и пролиферации плюрипотентных клеток внутреннего зародышевого слоя. Одновременно эти клетки блокируют неконтролируемую пролиферацию эмбриобласта (позже эпибласта) in situ. Только малая доля клеток эмбриобласта на этапе бластоцисты сохраняет тотипотентность, так как только 1-2% клеток удается переводить в бессмертную самопроизводящуюся линию ЭСК [13].

Репрограммирование эмбриобласта в линию ЭСК начинают с механического отделения эмбриобласта от трофобласта. Затем фрагменты эмбриобласта помещают на "фидер" из фетальных фибробластов без факторов, ограничивающих пролиферацию тотипотентных клеток.

Thomson et al. [77] предложили для выращивания ЭСК использовать среду Дульбекко над облученным фидером (ингибирована пролиферация фетальных фибробластов) с одновременным добавлением в среду культивирования 3-х ростовых цитокинов – LIF (leukemia inhibitory factor), IL-6, SCF (stem cell factor). Для более активной пролиферации ЭСК рекомендуется дополнительно использовать FGF-base, EGF, TGF-β.

В последние годы были разработаны методы длительного пассирования ЭСК в течение 1- 2-х и более лет без изменения их гено/фенотипа, причем культуры ЭСК могли пройти за этот срок более 450 циклов самоудвоения без анеуплоидии и малигнизации. Необходимо подчеркнуть, что рост ЭСК в культуре идет клонами с образованием клеточных агрегатов (эмбриоидные тельца).

Образование эмбриоидных телец начинается с агрегации однородных СК, которые пролиферируют и по мере нарастания клеточной массы (клеточности) изменяют состав внутренней локальной микросреды с формированием концентрационных градиентов веществ, которые приводят к изменению экспрессии генов и развитию процессов дифференцировки клеток внутри эмбриоидного тельца. Процесс формирования градиента концентраций веществ протекает динамично по мере нарастания клеток и касается в первую очередь изменений концентраций СО₂, NO, O₂, глюкозы, а затем состава пептидов и факторов роста. Это в свою очередь меняет характера межклеточных «cell-cell» взаимодействий и ведет к формированию клеток различных по направлению дифференцировки. Когда клеточные агрегаты достигают размеров 50-80 клеток, наступает равновесие между пролиферацией и апоптозом. Спонтанную дифференцировку и гибель клеток обычно предотвращают повторным диспергированием агрегатов.

Дифференцировка ЭСК наступает после смены среды, удаления фидера и LIF, а также добавления сыворотки, что ведет к прикреплению клеток к подложке, образованию монослоя и формированию их цитоскелета.

Для прикрепления клеток к подложке добавляют не только сыворотку, но и индукторы цитодифференцировки в строго определенных концентрациях, преимущественно белки, которые участвуют в ранних стадиях формирования различных клеточных типов. Для этих целей используют активин А, который индуцирует преимущественно мезодермальную дифференцировку и главным образом образование мышечных клеток (скелетных, кардиомиоцитов); эпидермальный фактор роста, который индуцирует образование мезодермальных и эктодермальных клонов (специфичен для образования клеток кожи); нейрогенный фактор роста, который способствует образованию клонов клеток мезодермы, эктодермы и эндодермы (специфичен для образования клеток печени и эндокринной части поджелудочной железы). При обработке ЭСК нейрогенным фактором роста и ретиноевой кислотой формируется клеточная популяция, содержащая около 50% клеток, несущих маркеры нервных клеток (окраска антителами к нестину, виментину, polysyalated – NCAM, MAP-2, NeuN, betaIII-tubulin) [13].

Предполагают, что ретиноевая кислота может также выступать в роли индуктора образования мультипотентных мезенхимальных клонов в культуре, которые далее в зависимости от используемых доз и дополнительного набора сигнальных молекул и генов "второго эшелона", определяющих направление цитодифференцировки, воспроизводят адипогенез, миогенез, кардиогенез и т.д.

Экспрессии генов созревания кардиомиоцитов способствует также добавление в среду культивирования ДМСО, который выполняет роль вектора для доставки гидрофобных сигналов (ретиноевая кислота, цитокины с гидрофобными доменами) в ядро ЭСК. Накопление кислородных радикалов и электрическая стимуляция ЭСК в культуре также ускоряют образование зрелых спонтанно сокращающихся кардиомиоцитов [48]. Показано [51], что в эмбриональных агрегатах ЭСК можно добиться также дифференцировки клеток в хондроциты, причем в роли главных сигналов хондрогенеза выступают подобранные концентрации белков BMP-2, BMP-4 и TGF-β, вырабатываемых, как известно, клетками мезенхимы. Фидер OP9 из стромальных клеток, а также VEGF, FGF-β и HGF поддерживают рост эндотелиальных клонов мезодермы.

Показано, что дифференцировка ЭСК в нейроны, кардиомиоциты и клетки других фенотипов (хондроцитов) идет in vitro в среднем 10-15 дней, тогда как аналогичный процесс в зародыше занимает 5-7 дней. Очевидно, это связано с тем, что наработка соматических клеток из ЭСК идет в обход эмбриогенеза, когда отсутствуют условия для организованного взаимодействия мезенхимы и провизорных клонов клеток всех трех зародышевых листков. В результате только часть событий клеточного и органного морфогенеза хаотически воспроизводится в культуре эмбриоидных агрегатов.

Важно отметить также, что при создании условий дифференцировки клеток в определенном направлении только незначительная часть клеток начинает проявлять свойства заданного фенотипа (не более 1/3). Именно поэтому получение клеток определенного фенотипа пока представляет собой непростую задачу, решение которой осуществляется путем этапных воздействий определенными химическими сигналами на спонтанно формирующиеся эмбриоидные агрегаты ЭСК (обычно мыши и/или человека) с расшифровкой экспрессирующихся при этом генов, а также путем ген-индуцированной стимуляции дифференцировки в предварительно трансфецированных ЭСК [13]. Так, стимуляции кардиогенеза в ЭСК достигают избыточной дозой введенного в клетки гена Nкх-5-2, эритропоэза – избыточной дозой Hох-B4, нейрогенеза - избыточной дозой Neuro-D, миогенеза – MyoD гена. Дифференцировка эмбриоидных агрегатов ЭСК в гепатоциты достигалась введением в клетки гена резистентности к бластоцидину S (антибиотик) под промотор маркерного гена Oct4, а также использованием селективного красителя индоцианина зеленого для отбора колоний появляющихся гепатобластов, которые далее в культуре дифференцируются до кластеров распластанных гепатоцитов. Получениию инсулин- и глюкагон-секретирующих клеток сопутствует осуществление направленной дифференцировки эмбриоидных агрегатов ЭСК в клоны нейральных стволовых клеток, обогащенных нестин^+.-клетками, т.к. образование гормон-продуцирующих клеток всегда происходило среди колоний нейросфер и параллельно дифференцировке нейральных стволовых клеток. В результате культивирования в таких условиях 18% нейросфер дифференцировались в инсулин- и глюкагон-секретирующие клетки, а 20% нейросфер – дифференцировалось в клетки с нейрональными и гормон-продуцирующими свойствами одновременно [13].

Так как клетки, образующиеся в процессе дифференцировки ЭСК, приобретают способность стабильно и длительно сохранять свой фенотип в лабораторных условиях (в отличие от РСК), то это свойство искусственно полученных соматических клеток открывает перспективу наработки и хранения терапевтически эффективных доз дифференцированных клеток, а также применения их с лечебными целями.

Например, в опытах на животных уже показано [36,48], что кардиомиоциты, выращенные in vitro из плюрипотентной зародышевой ткани, активно встраиваются в миокард развивающихся зародышей (тканевой химеризм), а также в ишемически поврежденную ткань. Предшественники олигодендроцитов, лабораторно полученные из ЭСК, при трансплантации стимулируют ремиелинизацию в поврежденном мозге животных [31,58].

Лабораторно полученные бета-клетки снимают гипергликемию у животных с экспериментальным диабетом [73].

Ярко выраженные потенции ЭСК к репопулированию и дифференцировке в различные типы соматических клеток in vitro и отчетливо выявившаяся возможность осуществления ген-индуцированной селекции ЭСК являются важнейшими предпосылками для реализации промышленного получения высококачественных стандартизированных клеточных линий клеток заданного направления дифференцировки (получение клеточных препаратов); возможность проведения ген-индуцированной селекции позволяет также устранить условия для появления в культуре недифференцирующихся (онкогенных) клонов клеток, создающих опасность перерождения их в тератокарциномные опухоли при трансплантации.

Технологические достижения последних лет обусловили тот факт, что ЭСК стали наиболее привлекательным и многообещающим объектом исследований в современной клеточной биологии и медицине [13,29,41].

Между тем, отсутствие удовлетворительного законодательного решения проблем терапевтического клонирования ЭСК человека как в России, так и других странах мира тормозит изучение клинической эффективности применения предифференцированных ЭСК, а также препятствует оценке предложенных способов защиты реципиентов от переноса им при трансплантации онкогенных клонов клеток. В результате ЭСК пока по прежнему остаются только уникальным объектом лабораторных и экспериментальных исследований.