Региональные (взрослые) СК.

Региональные СК (РСК), в частности аутологичные СК костного мозга, в отличие от ЭСК, уже используются в клинике для восстановительного лечения нарушенных функций сердца, печени, а также для устранения дефектов костей [18,25,66,67,74,83] и заживления ожоговых ран [11]. Активное использование РСК для целей регенерационной медицины оказалось возможным благодаря отсутствию правовых ограничений на их применение, доступности получения, онкологической безопасности и иммунологической совместимости этих клеток, т.к. донорами РСК обычно являются сами реципиенты (больные).

В отличие от плюрипотентных ЭСК – РСК уни-, ди- и мультипотентны. Они имеют сниженную популяционную активность (низкая активность теломеразы) и ограниченный потенциал дифференцировки.

Именно поэтому для РСК в условиях in vitro и in vivo особенно важны сигналы культурального и тканевого микроокружения, под влиянием которых РСК дифференцируются в соответствующие зрелые специализированные клетки, поддерживая стабильность процессов самообновления органов и тканей (физиологическая регенерация). Для некоторых типов РСК (СК костного мозга) доказана их способность к миграции в зону поражения.

Проблемы, возникающие при использовании РСК для клеточной терапии, связаны с тем, что еще недостаточно изучены факторы их дифференцировки in vivo и in vitro: отсутствуют окончательные ответы на вопросы: можно ли повысить пролиферативную активность РСК in vitro для получения достаточных количеств донорского материала и какие сигналы in vivo регулируют процессы пролиферации и дифференцировки этих клеток; кроме того, отсутствуют стандартизированные и не слишком дорогостоящие технологии получения очищенных РСК и не изучены возможности устранения возрастного снижения количеств РСК в органах и их терапевтической эффективности.

Остаются не изученными механизмы реализации терапевтических эффектов РСК в организме, связь биологической активности собственных РСК, с тяжестью состояния больного, возможность восстановления нарушенных функций необратимо поврежденного органа с помощью тех аутологичных РСК, которые длительное время находились в организме в условиях ингибирующего воздействия на них факторов развивающегося иммунодефицита и т.д.

Основным источником получения РСК для клеточной терапии служат собственные ткани взрослого человека. Перечень тканей, содержащих СК, постоянно расширяется, и в настоящее время включает: костный мозг, периферическую и пуповинную кровь [15,82], головной мозг (зубчатое ядро гиппокампа, обонятельная луковица и субэпиндимальная зона латеральных желудочков) и спинной мозг [75,39], дентальную пульпу, кровеносные сосуды [49,69], скелетные мышцы (сателлитные клетки) [53], эпителий кожи [72] и пищеварительного тракта [70,72], роговицу, ретину, печень [22,76] и поджелудочную железу [43,85].

Практически наиболее удобными источниками получения РСК из органов взрослого человека являются: костный мозг, периферическая и пуповинная кровь [15,32,79], а также биопсийный материал (глубокие слои носоглоточного эпителия, имеющие нейрональное происхождение, клетки печени, эпителий кишечника и др.).

Поскольку свойства СК поздних эмбрионов и плодов близки к свойствам РСК взрослых организмов (они отличаются более высокой популяционной активностью), то абортный материал также может служить источником получения РСК, начиная с 5-8-12 недели гестации.

Перед трансплантацией РСК культивируют – освобождают от тканевого балласта и создают условия для клонирования и дифференцировки, так как известно, что выход СК в дифференцировку и направление дифференцировки регулируются сигналами микроокружения и их специфичностью [6].

При культивировании РСК, как и при культивировании ЭСК, выявляется общая закономерность выживания клеток в культуре. Она состоит в том, что при создании условий направленной дифференцировки клеток только часть клеток обнаруживает свойства дифференцировки в заданном направлении (это подтверждается особенностями морфологической структуры, гистохимическим или иммуно-гистохимическим выявлением маркерных белков). Остальные клетки (до 2/3 клеточной популяции), образуя структуры кластеров с дифференцированными клетками, относятся к клеткам иного направления развития. Эти клетки имеют общность эмбрионального происхождения с дифференцированными клетками и очевидно, в культуре выполняют функции фидерного слоя. Так, нейроциты в культуре окружены клетками глии, также имеющими эктодермальное происхождение [9,12], миоцито- и кардиомиоцитоподобные клетки окружены фибробластами – клетками мезодермального происхождения [19].

Невозможность выклонировать чистую культуру дифференцированных клеток подтверждает, по нашему мнению, участие РСК в формировании структурной целостности ткани и в создании ее апуд-системы, обеспечивающей адекватное функционирование в ней специализированных клеток.

Неудивительно поэтому, что и в условиях in vitro или при повреждении тканей РСК проявляют свои уни-, ди- или мультипотентные свойства, дифференцируясь в клетки тех тканей, из которых они происходят.

Так, из фракции гемопоэтических СК костного мозга могут быть получены клетки крови и иммунной системы; из фракции стромальных СК костного мозга – другие клетки мезенхимального происхождения: остеобласты, хондроциты, фибробласты, тендоциты, миоциты, кардиомиоциты, адипоциты и др. [46,57,68]; из нейрональных СК могут быть получены различные нейроны (холинэргические, пептидэргические, дофаминэргические, GabA-эргические и др.), а также глиальные клетки (астроциты, олигодендроциты, шванновские – миелинпродуцирующие клетки, клетки микроглии) и клетки наружного (кожного) эпителия [61,80]; из СК печени (овальные клетки) могут быть получены гепатоциты и эпителий желчных протоков [42,56,78]; из СК кишечного эпителия – α, β, и γ клетки поджелудочной железы, а также эпителий кишечника [28]; из прогениторных эпителиальных клеток поджелудочной железы – гепатоциты [34], и т.д.

В последние годы РСК стали объектом особенно пристальных исследований. Стали появляться работы, указывающие на способность РСК дифференцироваться in vivo не только в клетки того органа или той системы организма, к которой они принадлежат, но и в клетки других органов и тканей, происходящих даже из другого зародышевого листка. Это свойство РСК, названное пластичностью [30,52] или трансдифференцировкой [24,54], возбудило надежды на возможность регенерации практически любого поврежденного органа и явилось причиной, теперь уже правда стихающего, бума вокруг уникальности терапевтических свойств этих клеток (источники получения "запчастей" организма). Так, в ряде работ утверждалось, что СК нервной ткани могут превратиться в миоциты и гемопоэтические клетки [40,80], СК печеночной ткани в миоциты [59]; появились утверждения, что гемопоэтические СК костного мозга также могут трансдифференцироваться в скелетные мышцы [38,44], гепатоциты [54], эпителиальные клетки [52], нейроглию [37], нейроны [30,60], эндотелиальные клетки и кардиомиоциты [45,66] после трансплантации их в соответствующие поврежденные ткани организма. Для доказательства трансдифференцировки гемопоэтических СК использовали клетки костного мозга, которые предварительно маркировали GFP (зеленый флуоресцирующий протеин). После пересадки таких клеток, например, в поврежденный миокард часть кардиомиоцитов становилась меченной этим красителем, и это дало авторам основание утверждать, что произошло превращение клеток костного мозга в клетки сердечной мышцы [66].

Аналогичные сведения приводят Jackson с соавторами (45), которые, вводя облученным грызунам в зону инфаркта фракцию стромальных клеток костного мозга, обнаруживали затем в этих клетках кардиоспецифический белок – тропонин.

Во все увеличивающемся числе работ признается, что при повреждении миокарда, печени, мозга и других органов костный мозг служит поставщиком клеток-предшественников для этих органов, поскольку клетки регенерирующих органов после трансплантации костного мозга приобретают черты донорского фенотипа. Однако остается неясным: какие клетки костного мозга поступают в поврежденные органы и каким путем они участвуют в процессах регенерации – путем трансдифференцировки или путем клеточного слияния (fusion), то есть химеризации (гибридизации) клеток?

В подавляющем большинстве работ последних 2-х лет с помощью молекулярно-генетического метода – RT PCR, позволяющего по специфичности ДНК выявлять индивидуальные (клеточноспецифические) поверхностные маркерные белки, метода FACS (fluorescence-activated cells sorter), цитогенетического метода FISH (fluorescence in situ hybridisation), исключительно точного при наличии различий между кариотипом донора и реципиента, было установлено, что гемопоэтические СК костного мозга участвуют в процессах регенерации не за счет их трансдифференцировки, а преимущественно путем их слияния (химеризации) с клетками поврежденного органа [23,62,63,81].

Следует заметить, что слияние клеток является, по-видимому, одним из распространенных механизмов клеточного выживания в организме. Склонность к слиянию имеют моноциты, макрофаги (образование гигантских клеток с несколькими ядрами вокруг инородного тела, слияние В-лимфоцитов с дендритными клетками), а также эритроциты. Возникновение "гибридных эритроцитов", имеющих антигенные маркеры и донора и реципиента, рассматривается даже как непременный атрибут HLA-идентичных трансплантаций костного мозга [4]. Гибридные многоядерные клетки (со свойствами и донора, и реципиента) после трансплантации костного мозга обнаруживают также в гепатоцитах регенерирующей печени, в клетках миокарда, в эпителии почки, органах желудочно-кишечного тракта и в эпителии тимуса, что может приводить к толерантности по отношению к донорским клеткам [22,23,27,50,65,71].

Известно, что для реализации процесса гибридизации соматических клеток необходимо: слияние мембран контактирующих клеток, для чего они должны быть обратимо повреждены, а также наличие у контактирующих клеток высокого пролиферативного потенциала. В результате в момент деления таких клеток, когда их ядерные оболочки исчезают, создаются реальные условия для слияния хромосом и образования гибридной клетки [1]. Неудивительно поэтому, что большинство авторов подчеркивает необходимость для гибридизации высокого пролиферативного уровня контактирующих клеток. Именно такие условия возникают при терапии СК костного мозга, которые сами обладают высокой популяционной активностью и которые при введении в ткань пораженного органа вступают в контакт с его регенерирующими клетками.

Особого внимания заслуживает еще одно обстоятельство. Показано, что усиленный синтез ДНК клетками регенерирующих органов сопровождается явлением реутилизации ДНК их клеток другого гистотипа, в частности, из введенных лимфоидных клеток.

Из этих наблюдений можно заключить, что костный мозг, будучи лимфоидным органом, становится донором клеток-предшественников мононуклеарного ряда, ядерный материал которых может принять участие в процессах слияния (химеризации) клеток. Работы последних лет не исключают возможность существования таких механизмов [23,84], так как было показано, что при введении свежевыделенных клеток костного мозга они сливались с соматическими клетками печени, головного мозга и сердца без признаков их трансдифференцировки, но при этом в значительной части трансплантированных клеток (выявлялись по GFP) экспрессировались клетки с антигенами CD45⁺ (лейкоциты) и в меньшей степени с антигенами CD3⁺ (Т-лимфоциты); остальные клетки идентифицировались как фибробласты. В работе Balsam et al. [26] было также подтверждено, что фракция долгоживущих гемопоэтических СК (c-kit^enz, Lin^-c-kit⁺ и c-kit⁺Thy1.1^lo Lin^-Sca-1⁺), введенная в ишемизированный миокард мышей и выявляемая по GFP, не экспрессирует кардиоспецифические белки, а также маркеры гладко-мышечных или эндотелиальных клеток (α-актинин, коннексин, гладко-мышечный актин). В то же время, эти клетки дифференцируются исключительно в традиционные гемопоэтические клетки, генерируя образование миелоидных (CD45, Gr-1), реже В-лимфоидных (В220) и еще реже Т-лимфоидных (CD3) типов клеток, одно из назначений которых, как известно, участвовать в иммунной регуляции местных восстановительных процессов.

Если все-таки признать существование механизма трансдифференцировки РСК (и, прежде всего, гемопоэтических СК костного мозга) в клетки иного гистотипа, то возникает ряд вопросов, которые требуют специальных ответов.

Один из них состоит в том, почему СК, например, нервной ткани, печени, гемопоэтической ткани, "охотно" превращаются в клетки другой ткани и весьма пассивно участвуют в регенерации собственной ткани. Второй вопрос касается способности СК вызывать процесс дедифференцировки и сделать его полным перед трансдифференцировкой. Между тем, с помощью современных методов исследований не удается подтвердить существование механизмов дедифференцировки в клетках регенерирующих органов. Был подтвержден лишь возврат при этом к более ранним стадиям зрелости клеток, без утраты ими своего исходного гистотипа, причем глубина этого процесса при регенерации разных тканей была неодинаковой [5].

Из клетокже костного мозга только лимфоциты способны превращаться в менее зрелые формы – лимфобласты и приобретать утраченную способность к делению. Гемопоэтическая СК по своим морфологическим признакам имеет сходство с малым лимфоцитом и поэтому возможность превращения ее в клетки других тканей требует строгих доказательств, получение которых по-видимому следует ожидать в опытах с культурами клеток.

Имея некоторый опыт работы со СК костного мозга, в том числе с клетками гемопоэтического ряда [18,19] мы подтверждаем их чрезвычайно активную роль в ускорении восстановительных процессов в поврежденных органах и тканях. Мы однако полагаем, что эту важную роль СК костного мозга реализуют не за счет заместительных, а за счет своих индуктивных и информационных свойств, высокий уровень которых поддерживается в этих клетках уровнем их популяционной (генной) активности и адекватным микроокружением. Использование СК от пожилых доноров и трансплантация их в зоны с глубоким нарушением трофики (развитие фиброза) должно «очевидно» вести к ослаблению их регуляторной роли.