 |
Питательные среды для работы с облигатно анаэробными микроорганизмами
|
|
|
|
(адаптировано; по «Clinical Microbiology Procedures Hadbook», 1995 г.)
| Название питательной среды | Аббревиатура или иное название среды | Назначение питательной среды |
| Сердечно-мозговая плотная среда | BHI-agar | Среда общего назначения. Должна быть обогащена гемином и витамином К. Обеспечивает рост облигатно- и факультативно анаэробных бактерий. |
| Бруцелла-агар с кровью | –– | То же |
| Анаэробный кровяной агар | CDC anaerobe agar | Среда общего назначения (см.выше). Особо выделяется, как оптимальная для грамположительных анаэробных бактерий. |
| Агар Шедлера с кровью | Schаedler¢s agar | Среда общего назначения, обогащенная (см.выше). Считается оптимальной для выделения требовательных анаэробных бактерий. |
| Канамицин-ванкомицин кровяной агар | LKV-agar KLVB-agar | Для изоляции и селекции бактероидов и обнаружения пигментообразующих грам-отрицательных палочек. Обогащена гемином, витамином К1 и лаковой кровью. |
| Фенилэтилалкоголь агар | РЕА | Селективная среда. Подавляет рост факультативно анаэробных грамотрицательных палочек |
| Бактероидный желчно-эскулиновый агар | BBE-agar | Для селективного выделения и предварительной идентификации бактерий группы B.fragilis |
| Яично-желточный агар (вар.яично-желточный агар с неомицином) | EYA (NEYA) | Селективная и диагностическая среда для клостридий, а также для других анаэробов (некоторые виды превотелл и фузобактерий), образующих липазу и лецитиназу. |
| Бруцелла агар с цефокситином, циклоспорином и фруктозой | CCFA | Селективная и диагностическая среда для Clostridium difficile |
| Тиогликолевая среда, обогащенная | THIO medium | Среда с малым количеством агара, обогащенная гемином, витамином К, а также сывороткой крови (по показаниям). Для многих видов анаэробных бактерий. |
|
|
|
В зарубежной практике для выделения и культивирования неспорообразующих облигатно анаэробных бактерий в качестве базовых питательны сред часто называют агар Шедлера (Schaеdler agar), среду для бруцелл, обогащенную кровью, витамином К и гемином (ее пропись приведена в разделе питательных сред для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам), анаэробный кровяной агар (СDС anaerobic agar).
Агар Шедлера включает (на литр)
Казеиновый пептон 5,7 г
Соевый пептон 1,0 г
Мясной пептон 2,5 г
Дрожжевой экстракт 3,0 г
Глюкоза 2,8 г
Гемин 0,01 г
L-цистин 0,4 г
Трис-буфер 3,0 г
Натрия хлорид 5,7 г
Дикалия гидрофосфат 0,8 г
Витамин К1 0,01 г
Баранья кровь 50,0 мл
Агар-агар 15,0 г
рН 7,6 ± 0,2
Кровь добавляют стерильно в приготовленную, расплавленную и охлажденную до 45оС среду перед разлитием в чашки Петри. Среда имеет несколько не отличающихся принципиально прописей, что не меняет ее назначения.
Для выделения и первичной идентификации B.fragilis и других представителей близкой к ней группы бактероидов нашла применение агаризованная желчно-эскулиновая среда (ВВЕ-agar) следующего состава (на литр).
Панкреатический перевар казеина 15,0 г
Перевар соевой муки 5,0 г
Желчь сухая 20,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
Эскулин 1,0 г
Цитрат аммонийный железа 0,5 г
Витамин К1 0,01 г
Гемин 0,125 г
Гентамицин 0,1 г
Агар-агар 15,0 г
рН 7,0 ± 0,2
Гемин, витамин К1 и гентамицин вводят в готовую и охлажденную до 45 – 50оС среду. Желчь выполняет селекционирующую функцию (B.fragilis дает рост на средах с желчными солями). Гидролиз эскулина (с образованием эскулетина) в сочетании с солью железа придает черно-коричневую окраску среде вокруг колоний. Сами колонии B.fragilis и представителей ее группы округлые, имеют серую окраску и достигают диаметра 1 мм или более.
Имеется несколько других прописей, декларируемых как среды для бактероидов, которые, однако, не имеют в своем составе селективных или диагностических компонентов, а представляют собой обогащенные варианты сред обязательно с гемином и витамином К1.
|
|
|
В качестве среды, обеспечивающей рост широкого круга анаэробных бактерий, включая бактероиды, и, в то же время, обладающей селективными свойствами, предложена среда, содержащая фенилэтиловый спирт в качестве селекционирующего агента. Последний подавляет рост факультативно анаэробных микроорганизмов, в т.ч. энтеробактерий. Среда известна как фенилэтилалкоголь агар или РЕА-аgar. Ее состав на литр.
Перевар соевой муки (папаиновый) 23,0 г
Глюкоза 1,0 г
Дрожжевой экстракт 2,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
Гемин (1% раствор) 10,0 мл
L-цистин 0,4 г
Витамин К1 (1% раствор) 1,0 мл
Агар-агар 15,0 г
Фенилэтиловый спирт 2,7 мл
Кровь баранья 50,0 мл
рН 7,0 ± 0,2
Два последних компонента добавляют в готовую, расплавленную и охлажденную до 45 – 50оС среду непосредственно перед приготовлением чашек.
Для выделения фузобактерий предложена селективная среда с антибиотиками, FAA-среда (в некоторых работах она помечена как среда для требовательных анаэробов). Ее состав на литр
Пептон 23,0 г
Глюкоза 1,0 г
Натрия хлорид 5,0 г
L-аргинин 1,0 г
Натрия пируват 1,0 г
Крахмал растворимый 1,0 г
L-цистина гидрохлорид 0,5 г
Натрия сукцинат 0,5 г
Натрия гидрокарбонат 0,4 г
Натрий фосфорнокислый пиро 0,25 г
Гемин 0,05 г
Витамин К1 0,01 г
Неомицин 0,1 г
Ванкомицин 0,005 г
Джозамицин 0,003 г
Агар-агар 12,0 г
Кровь баранья дефибринированная 50,0 мл
рН 7,2 ± 0,2
Эта же среда без антибиотиков предложена для культивирования широкого круга анаэробных бактерий. Некоторые авторы считают достаточно вводить в среду только неомицин (0,1 г/л) и ванкомицин (0,0075 г/л) для селективного выделения фузобактерий.
Селективными и, одновременно, диагностическими свойствами обладает среда для Fusobacterium necrophorum следующего состава (на литр).
Панкреатический перевар казеина 32,0 г
Пептон 12,0 г
Магний сернокислый 5,0 г
Динатрия гидрофосфат 5,0 г
Глюкоза 5,0 г
Кристаллический фиолетовый 0,023 г
Агар-агар 16,5 г
Эмульсия яичного желтка (50%) 90,0 мл
Раствор фенилиэтолового спирта (0,27%) 1,35 мл
рН 7,3 ± 0,2
Эмульсия яичного желтка готовится следующим образом. Обрабатывают антисептиком 24 яйца. У 22 из них отделяют яичный желток и смешивают его с содержимым 2 других яиц. Добавляют 100 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Тщательно смешивают.
|
|
|
Аналогичный принцип заложен в пропись еще одной селективной и диагностической среды, рекомендованной к использованию Американским микробиологическим обществом. Среда известна как яично-желточный агар с неомицином (Egg Yolk Agar) или как агар Lombard-Dowell (LD agar) с неомицином. Среда рекомендована для выделения Fusobacterium necroрhorum, Prevotella intermedia, клостридий. LD agar является основой для многих вариантов питательных сред, используемых при работе с облигатно анаэробными бактериями. Состав ее на литр следующий.
Панкреатический перевар казеина 5,0 г
Дрожжевой экстракт 5,0 г
Натрия хлорид 2,5 г
L-цистин 0,4 г
L-триптофан 0,2 г
Натрий сернистокислый 0,1 г
Гемин 0,01 г
Витамин К1 0,01 г
Натрия гидроокись (1 N) 5,0 мл
Агар-агар 20,0 г
рН 7,5 ± 0,2
Селективный и диагностический вариант среды, приведенной выше, включает
LD агар 900,0 мл
Яично-желточная эмульсия 10,0 мл
Магний сернокислый (5% раствор) 0,02 мл
Динатрия гидрофосфат 0,5 г
Глюкоза 0,2 г
Неомицина сульфат 0,01 г
Приготовление яичной эмульсии:смешивают содержимое 1 яйца с яичным желтком 11 яиц.
Эмульсию яичного желтка и неомицин вносят асептично в расплавленную и охлажденную до 45 – 50оС среду перед ее разлитием в чашки Петри.
Дифференциация анаэробов идет по их способности продуцировать липазу, лецитиназу и протеазы (образование преципиата вокруг колоний –– лецитиназа, перламутовая переливающаяся окраска колоний –– липаза, зона просветления вокруг колоний –– протеаза).
Среди других вариантов LD агара значительным диагностическим потенциалом обладает также т.н. LD эскулин агар, имеющий следующий состав на литр.
Панкреатический перевар казеина 5,0 г
Дрожжевой экстракт 5,0 г
Натрия хлорид 2,5 г
Эскулин 1,0 г
Железа цитрат 0,5 г
L-цистин 0,4 г
L-триптофан 0,4 г
Гемин 0,2 г
Витамин К1 0,01 г
Натрия гидроокись (1 N) 1,0 мл
Агар-агар 20,0 г
рН 7,5 ± 0,2
Микроорганизмы, гидролизующие эскулин, меняют окраску среды вокруг колоний от красно-коричневой до темно-коричневой. Бактерии, продуцирующие H2S образуют колонии черного цвета.
|
|
|
Для бактерий, дающих рост в присутствии желчи (B.fragilis и ее группа), предложен вариант этой же среды, содержащий сухую желчь или соли желчных кислот. Он имеет много общего с составом среды, уже приведенной ранее. Жидкий вариант (бульон LD) предложен для культивирования различных облигатно анаэробных бактерий.
В отечественных методических рекомендациях, названных в начале этой главы, также дано несколько прописей диагностических питательных сред. Для определения лецитиназной (лецитовителлазной) и липазной активности рекомендована среда следующего состава.
Гидролизат Хоттингера
(120 мг% аминного азота) 1000,0 мл
Динатрия гидрофосфат 5,0 г
Калия дигидрофосфат 1,0 г
Натрия хлорид 2,0 г
Магний сернокислый 0,1 г
Глюкоза 20, г
Гемин (1% раствор) 1 мл
Агар-агар 20,0 г
Взвесь желтка 200,0 мл
рН 7,6
Взвесь желтка рекомендовано готовить, используя 1 желток на 200 мл физиологического раствора.
Для определения протеолитической активности анаэробных бактерий предложено использовать среду с желатином.
Гидролизат Хоттингера
(120 мг% аминного азота) 1000,0 мл
Натрия хлорид 5,0 г
Глюкоза 5,0 г
Желатин 100,0 – 150,0 г
L-цистеин солянокислый 0,25 г
Гемин (1% раствор) 1,0 мл
Витамин К1 (0,01% раствор) 1,0 мл
рН 7,1 – 7,2
Для определения сахаролитических свойств анаэробов рекомендовано пользоваться пептонно-дрожжевым бульоном с добавлением необходимого углевода. Пропись бульона следующая (на литр).
Пептон 10,0 г
Дрожжевой экстракт 10,0 г
Глюкоза или др.углевод 10,0 г
L-цистеин солянокислый 0,5 г
Гемин (1% раствор) 1,0 мл
рН 7,0
К среде может быть добавлен резазурин как показатель редокс-потенциала. Подчеркивается необходимость вести работы в токе бескислородного газа. Прокипяченная (восстановленная) среда не должна иметь розовой окраски – резазурин в процессе кипячения должен быть обесцвечен.
В заключение приведем селективную и диагностическую среду, предложенную для выделения Clostridium difficile, которая имеет следующий состав (на литр).
Пептон 8,0 г
Гидролизат казеина 18,0 г
Глюкоза 1,0 г
Дрожжевой экстракт 2,0 г
Дикалия гидрофосфат 2,5 г
Фруктоза 6,0 г
Нейтральный красный 0,03 г
Циклосерин 0,5 г
Цефокситин 0,016 г
Агар-агар 15,0 г
рН 7,4 ± 0,2
C.difficile устойчива к большинству противомикробных лекарственных средств. Поэтому в рецептуру введены антибиотики, подавляющие широкий круг бактерий кишечника, включая ряд облигатных анаэробов (цефокситин) Поскольку микроб изменяет рН среды в щелочную сторону, колонии и среда вокруг них приобретают желтый цвет.
|
|
|
