 |
Результаты и их обсуждение
|
|
|
|
Метод контроля качественного и количественного анализа лизина.
Введение
Разработка методов количественного и качественного анализа аминокислот (АК) является важной задачей многих отраслей науки: медицины, биохимии, микробиологии, пищевой промышленности, фармакологии и сельского хозяйства. Проведение анализа осложняется тем, что АК относятся к классу амфолитов [1], и их
водные растворы представляют собой сложную многоионную систему, в состав которой входят как катионы и анионы, так и цвиттерионы АК. Кроме того, в такого рода системах протекают реакции протонирования/ депротонирования.
Получение АК возможно несколькими путями [2]: биотехнологическим, химическим синтезом и гидролизом природного белкового сырья. Получение оптически активных L-изомеров аминокислот из гидролизатов природных материалов связано с многоступенчатой и дорогостоящей очисткой. В микробиологическом синтезе образования большинства АК взаимосвязаны. При этом одни АК являются предшественниками для биосинтеза других.
В настоящее время наиболее точным методом контроля аминокислот в сложных смесях является высокоэффективная жидкостная хроматография, требующая дорогостоящего оборудования и постоянно обновляемой реактивной базы. Существующие иные способы количественного определения АК (неводное потенциометрическое и аргентометрическое титрование, экстракция, биосенсоры) требуют предварительной пробоподготовки, персонала высокой квалификации, труднодоступных и зачастую опасных реактивов, а так же являются длительными в исполнении или имеют большую ошибку определения. Активно создаваемые в настоящее время биосенсоры, например, для определения лизина [3], требуют подбора специфических ферментов и их иммобилизации и регенерации, не стабильны и имеют ошибку определения до 30 %.
|
|
|
Для облегчения анализа возможно предварительное разделение АК. Для фракционирования аминокислот применятся хроматография в тонком слое силикагеля или целлюлозы [4, 5]. Так же известны методы разделения аминокислот с помощью экстракции [6] и электрофореза [7]. Представленные процессы разделения АК сложны и длительны в исполнении.
Доступность и широкий выбор ионитов свидетельствуют о целесообразности их использования для разделения АК. Авторами [8, 9] разработан способ безреагентного ионообменного разделения тирозина и фенилаланина, основанный на различном сродстве индивидуальных АК к иониту. Процесс разделения тирозина и фенилаланина проходит по многоступенчатому механизму, к тому же для эффективности разделения требуется дополнительная терморегуляция.
Таким образом, известные методики основаны на многоступенчатых механизмах разделения, что приводит к существенному увеличению времени анализа. Поэтому, проблема разработки эффективных и экспрессных методик разделения аминокислот с использованием ионообменных смол весьма актуальна в настоящее время.
Целью настоящей работы явилось определение лизина с помощью разработанного нами потенциометрического сенсора после разделения смеси лизина и глицина, основанного на различных значениях pI АК, с использованием катионита КУ-2. При этом потенциометрический селективный сенсор для определения моногидрохлорида лизина в водных растворах впервые использовался в реальных, а не модельных системах.
Эксперимент
Объектыисследования. В качестве объектов исследования использовались индивидуальные и смешанные растворы моногидрохлорида лизина и глицина. Некоторые физико-химические характеристики исследуемых аминокислот представлены в таблице 1.
|
|
|
Таблица 1. Физико-химические свойства исследуемых аминокислот [1,10]
| Аминокислота | Обозначение | pI | pK1(COOH) | pK2(a-NH2) | pK3(e-NH2) | Растворимость при 25 0С, г/100 г Н2О | М, г/моль |
| Лизин | Lys | 9,59 | 2,18 | 9,12 | 10,35 | легко | 146,19 |
| Глицин | Gly | 5,97 | 2,34 | 9,60 | - | 75,05 |
Концентрации аминокислот в исследуемых растворах не превышали 4×10-3моль/л для глицина и 1,6×10-3моль/л для моногидрохлорида лизина. Значения рН исследуемых растворов находилось в диапазоне значений от 5 до 7. Для приготовления растворов использовали реактивы марки ч.д.а. и дистиллированную воду с сопротивлением 0,35 МОм×см2.
В качестве сорбента в работе использовался гелевый катионит КУ-2-8, предварительно переведенный в Na+-форму по стандартной методике [11].
Методика разделения. Схематическое изображение рабочей колонки представлено на рисунке 1. Высота колонки составляла 10 см, диаметр 1 см, скорость пропускания разделяемого раствора – 25 мл/ч.
Рис.1. Схематическое изображение рабочей колонки
Методика определения оптической плотности. Измерение оптической плотности D растворов аминокислот проводили на фотоэлектрическом колориметре-нефелометре ФЭК-56 в кварцевых кюветах толщиной 3 мм при длине волны 546 см-1. Измерения осуществляли по стандартной методике [12]. Погрешность измерения составила не более 5%.
Определение концентраций аминокислот в исследуемых растворах осуществляли методом градуировочного графика. В виду большого разброса концентраций исследуемых растворов построение градуировочных графиков в координатах D - С, где концентрация выражается в моль/л не информативно. Концентрационные зависимости оптической плотности для индивидуальных и смешанных растворов моногидрохлорида лизина и глицина в координатах D - C, где размерность концентрации, выраженная в мкг/мл, представлены на рисунке 2.
0,8 D
0,6
0,4
0,2
С,мкг/мл 0
0 50 100 150
Рис.2. Концентрационная зависимость оптической плотности для 1 – LysHCl+Gly, 2 – Gly, 3 – LysHCl
|
|
|
Зависимости оптической плотности индивидуальных и смешанных растворов глицина и моногидрохлорида лизина от их концентрации линейны с достоверностью аппроксимации 0,98.
Методом калибровочных графиков (рис. 2) показано, что для исследуемых растворов соблюдается закон аддитивности оптических плотностей (1).
|
где DLysHCl, DGlyи Dсмеси – оптическая плотность растворов моногидрохлорида лизина, глицина и их смеси соответственно.
Рассчитаны минимальные концентрации исследуемых растворов индивидуальных аминокислот, которые можно определить спектрофотометрическим методом в кюветах толщиной 3 мм при длине волны 546 см-1. Концентрация моногидрохлорида лизина и глицина составила 0,11 и 0,13 ммоль/л соответственно.
Методика проведения ТСХ. Для проведения ТСХ использовали пластины Silufol. Получение хроматограмм проводили по методике, описанной в [13].
Методика определения доннановского потенциала. В качестве лабораторной установки для количественного определения лизина в исследуемых растворах, использовали ячейку (схема представлена на рисунке 3) для оценки доннановского потенциала [14], в которой мембрана одним концом, уподобляемым датчику в ионоселективном электроде, погружена в исследуемый раствор С1, а другим концом – в раствор с концентрацией близкой к концентрации внутреннего раствора мембраны. Измерение производили с использованием двух хлорсеребряных электродов сравнения. В систему вводили солевые мостики, соединяющие электроды сравнения с рабочими растворами, для предотвращения разбавления рабочих растворов ионами калия. Состав солевых мостиков подбирали на основании уравнения Гендерсона [15] таким образом, чтобы суммарный вклад диффузионных потенциалов жидкостного соединения на их границах был минимален.
Для исследования были выбраны перфторированные сульфокатионитовые мембраны МФ-4СК.
Электрохимическая цепь (2) для оценки доннановского потенциала подробно представлена в [10]. Вклады скачков потенциала в общую ЭДС цепи на всех границах (3), кроме скачка потенциала на границе исследуемый раствор/ мембрана
|
|
|
|
|
Рис.3. Схематическое изображение ячейки для определения доннановского потенциала на границе исследуемый раствор/ мембрана: 1 – исследуемый раствор, С1;
2 – раствор сравнения, С2; 3 – мембрана; 4 – защитный ПЭ кожух; 5 – вольтметр; А, В – хлорсеребряные электроды
Ag⏐AgCl, KCl (A) ⏐исслед. р-р, С1⏐мембрана⏐р-р сравн., С2⏐(В) KCl, AgCl⏐Ag
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(2)
(3)
∆f KCl –
|
|
|
С2/насыщенный раствор KCl.
Все потенциометрические измерения выполняли на жидкостном анализаторе Эксперт–001–3 (0.1). Абсолютная погрешность прибора для измерения рН и ЭДС составляет ±0,02 и ±1,5 мВ соответственно. Для контроля рН использовали стеклянный электрод марки ЭЛС-43-07 и хлорсеребряный электрод сравнения марки ЭВС-1М3.1.
Результаты и их обсуждение
|
|
|
