 |
Уреаза (карбамид-амидогидролаза)
|
|
|
|
Уреаза гидролизует карбамид (мочевину) до аммиака и углекислого газа:
уреаза
NH2—С—NH2 + Н20 2 NH3 + CO2
║
О
В почве мочевина (карбамид) образуется в процессе превращения азотистых органических соединений - белков и нуклеиновых кислот. В значительном количестве карбамид вносится с навозом и в форме концентрированного азотного удобрения. Образовавшийся в результате уреазной реакции аммиак служит непосредственным источником азотного питания растений. Поэтому активность уреазы является одним из важнейших показателей биологической активности почв. Методы определения активности уреазы почвы основаны на учете количества аммиака, образующегося при гидролизе карбамида.
Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы помещают в колбы на 50 мл, добавляют 5 мл 3-процентной мочевины и 1-2 капли толуола. Контролем служат стерилизованная почва (180 °С, 3 ч) и субстраты без почвы. Колбы закрывают корковыми пробками, встряхивают и ставят в термостат при 80 0С на 24 ч. В течение инкубации колбы периодически встряхивают. По окончании инкубации в колбу добавляют 15 мл 1,0 н. раствора KCl и встряхивают в течение 5 мин для вытеснения из почвы аммиака. Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 5-10 мин при 3000 об./мин или фильтруют через складчатый беззольный фильтр. Берут пипеткой 2-10 мл фильтрата (в зависимости от содержания аммиака, в черноземах - 2 мл) в мерную колбу на 50 мл, дистиллированной водой доводят объем до 30 мл, перемешивают. Прибавляют из бюретки 2 мл 30-процентного раствора калия-натрия виннокислого, перемешивают. Прибавляют из бюретки 2 мл реактива Несслера, перемешивают, доводят водой до метки, перемешивают. Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах шириной 30 мм с синим светофильтром (длина волны 400 нм).
|
|
|
Количество аммиака рассчитывают до предварительно составленной калибровочной кривой. Стандартный раствор: 0,1 мг NH3 в 1 мл воды.
Примечание. Дистиллированную воду необходимо проверять на содержание аммиака. Контроль - предварительно стерилизованная сухим жаром почва при 180 0С в течение 3 ч.
Активность уреазы выражается в миллиграммах NН3 на 10 г почвы в сутки:
NН3 = (а - б) · p · 10 / н, где
а - количество аммиака по графику, мг;
б - количество аммиака в контроле по графику, мг;
р - разведение;
н - навеска воздушно-сухой почвы, г.
Реактивы:
1) 3-процентный раствор мочевины;
2) 1 н. раствор КСl (74,5 г хлористого калия растворить в дистиллированной воде и довести до 1 л);
3) 30-процептный раствор сегнетовой соли;
4) реактив Несслера;
5) стандартный раствор NH4Cl в концентрации 0,005 мг N—NH3, в 1 мл.
Фосфатаза
(фосфогидролазы моноэфиров ортофосфорной кислоты)
При определении фосфатазной активности в качестве субстрата используют различные моноэфиры фосфорной кислоты. Наиболее широко применяют водорастворимые соли фенолфталеинфосфата, фенилфосфата, глицерофосфата, α- или β-натрилфосфата и n-нитрофенилфосфата..При их ферментативном гидролизе выделяются минеральный фосфор и органический радикал субстрата.
Методы определения фосфатазной активности почвы основаны на количественном учете неорганического фосфора (молибденовокислым аммонием и др.) или спиртовой части гидролизованного субстрата.
Метод А.Ш. Галстяна и Э.А. Арутюнян [1966]
Ход анализа. 1 г воздушно-сухой почвы помещают в колбу емкостью 50 мл, добавляют 1 мл воды, прибавляют 1 мл 1 -процентного раствора фенолфталеинфосфата натрия, 1-2 капли толуола. Колбу закрывают корковой пробкой, встряхивают и ставят в термостат на 1 ч при 30 °С. После инкубации прибавляют 45 мл воды, 2 мл 10-процентного NH4OH, взбалтывают и фильтруют через плотный фильтр. Окрашенный в розовый цвет фильтрат колориметрируют на ФЭК с синим светофильтром. В случае мутной вытяжки для просветления раствора перед аммиаком в колбу добавляют 1 мл насыщенного раствора алюмокалиевых квасцов. Контролем служит стерилизованная почва (180 0С, 3 ч) и субстрат без почвы. Количество образующегося фенолфталеина находят по калибровочной кривой, составленной с различными концентрациями спиртового раствора фенолфталеина. Найденный в фильтрате фенолфталеин пересчитывают на отщепленный фосфор. При этом исходят из того, что в фенолфталеинфосфате одна молекула фенолфталеина связана с двумя молекулами фосфорной кислоты.
|
|
|
Активность фосфатазы выражают в миллиграммах Р2О5 на 100 г почвы за 1 ч.
Реактивы:
1) 1-процентный водный раствор фенолфталеинфосфата натрия;
2) 10-процентный NH4OH;
3) насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов;
4) стандартный раствор фенолфталеина: 0,01 г фенолфталеина растворяют в 60 мл этанола и объем доводят водой до 100 мл (в 1 мл 0,1 мг фенолфталеина). В мерные колбы емкостью 100 мл берут соответствующие количества стандартного раствора (в мл) с содержанием от 0,1 до 2 мг фенолфталеина и окрашивают, как описано выше.[25]
|
|
|
