 |
Иммуноферментный анализ (ИФА). Обнаружение вирусных антигенов (на примере диагностики ротавирусной инфекции)
|
|
|
|
Иммуноферментный анализ, предложенный более двадцати лет назад на пересечении иммунохимии и инженерной энзимологии, стал в настоящее время одним из распространенных методов исследований. Явным преимуществом данного метода, к которому относятся простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессивность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов, является обеспечение его прочного положения в клинической биохимии при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях.
Иммуноферментный анализ был предложен в начале 70-х гг. тремя независимыми группами исследователей — Engval, Pormann в Швеции, van Neamen, Schumes в Нидерландах, Rubenslen et al. в США. При этом методе антиген (или антитело), вступающие в иммунологическую реакцию, метится ферментом. По превращению ферментом добавляемого субстрата можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело. Чувствительность иммуноферментного анализа позволяет определить минимальные количества (нанограммы) белка антигена или антител.
Обнаружение специфических антител в физиологических жидкостях играет важную роль в клинической диагностике широкого круга заболеваний как инфекционного, так и аутоиммунного характера. Для этих целей были разработаны ряд разнообразных методов, в том числе РСК, РНГА, РИФ, РЗГА, латекс-агглютинация. Применяя эти методы для количественного определения реагента, требуется титрование в серийных разведениях. Кроме того, одним из недостатков вышеуказанных тестов является трудоемкость, невысокая точность и значительный элемент субъективности. Это связанно с тем, что, как правило, сложно отличить с достаточной надежностью слабую положительную реакцию от отрицательной.
|
|
|
Благодаря иммуноферментному анализу появилась возможность проводить количественные измерения в широком диапазоне концентраций с использованием лишь единичного разведения сыворотки или плазмы. Этот метод позволяет легко различать по активности антитела, принадлежащие к различным классам иммуноглобулинов.
Правильный подбор соответствующих антигенов, связанных с носителями, подходящий антииммуноглобулиновый конъюгат, содержащий ферментную метку, позволяют создать системы тестирования множества различных антигенов, основанных на одном и том же наборе манипуляций.
Постановка твердофазного иммуноферментного анализа на полистироловых панелях с целью выявления противовирусных антител имеет следующие стадии:
-иммобилизация растворимых антигенов на твердой фазе;
-отмывание несвязавшегося антигена буферным раствором с детергентом;
-связывание активных центров твердой фазы инертным белком;
-взаимодействие иммобилизированных антигенов с исследуемыми антителами и образование комплекса антиген-антитело;
-выявление комплекса антиген-антитело с помощью антииммуноглобулиновой сыворотки или белка А золотистого стафилококка, меченных ферментом;
-выявление с помощью субстратной смеси количества связанного фермента.
После прохождения реакции ее учитывают визуально или спектрофотометрически.
Для выявления антигенов вирусов в биологических жидкостях также используют твердофазный иммуноферментный анализ. Для выявления вирусных антигенов наиболее часто используют метод двойных антител или “сэндвич”-вариант. При этом в лунки полистироловых панелей иммобилизируют специфический гамма-глобулин, выделенный из специфической к данному антигену сыворотки.
Стадии выявления антигена следующие:
|
|
|
-иммобилизация на твердой фазе антител; отмывание их избытка буферным раствором с детергентом; обработка лунок панели инертным белком; внесение исследуемого антигена; отмывание; внесение конъюгата антител с ферментом; внесение субстратной смеси; учет результатов реакции.
Кроме твердофазного иммуноферментного анализа, имеется еще и гистологический вариант, или иммунопероксидазная реакция. Данная реакция аналогична реакции иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки иммуноферментного анализа используются антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом, а учет реакции проводится под обычным световым микроскопом.
В этом варианте иммуноферментного анализа используются антитела, меченные пероксидазой, так как молекулярная масса (40000) меньше, чем других ферментов и способствует лучшему проникновению пероксидазных конъюгатов через клеточные мембраны. Материалом для выявления вирусспецифических антигенов или вирусов с помощью иммунопероксидазного метода могут служить мазки-отпечатки из различных органов, парафиновые срезы, культура клеток, мазки крови.
При выявлении антигенов используют как прямой, так и непрямой иммунопероксидазные тесты. Для выявления вирусспецифических антигенов прямым иммунопероксидазным методом проводят следующие этапы: фиксация мазков-отпечатков или инфицированного монослоя, внесение конъюгата антител с ферментом, отмывание, внесение субстратной смеси и учет под микроскопом.
Различные варианты ИФА с целью выявления антигенов и антител нашли широкое применение для диагностики вирусных пневмоэнтеритов телят
Техника выявления ротавирусного антигена. Выпускаемый коммерческий набор для ИФА содержит все необходимы реагенты с указанием способа их приготовления и использования.
Из вспомогательных реактивов применяют:
калий фосфатно-буферный раствор, содержащий 0,1М хлористого натрия с конечной рН 7,2-7,4 (ФБР);
твин-калий фосфатный буфер (ТФБР), содержащий 0,05% твина-20 или твина-80 (на 1 литр ФБР добавляют 0,5 мл твин-20 или твин-80). Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения твина;
субстратная проявляющая смесь: 10 мг 5-аминосалициловой кислоты растворяют в 10 мл подогретой до 30—40°С дистиллированной воды, охлаждают и добавляют 0,1 мл 0,5 М натрия гидроокиси. Затем 10 мг перекиси водорода растворяют в 3-х мл дистиллированной воды и 1 мл вносят в 10 мл раствора 5-аминосалициловой кислоты.
|
|
|
На первом этапе в каждую лунку полистироловых плашек с плоским дном вносят по 0,2 мл иммуноглобулинов в рабочем разведении.
Плашку закрывают крышкой, выдерживают в течение двух часов при 37°С или 16—18 часов при 4°С и по истечению экспозиции удаляют раствор иммуноглобулинов, промывая каждую лунку 3—4 раза ТФБР.
На втором этапе, где в качестве исследуемого материала используют 25—50%-ную суспензию фекалий в разведении 1:50, готовят двойные разведения при визуальной оценке результатов реакции. При спектрофотометрическом учете результатов ИФА в раститровке нет необходимости. Плашки, в которых имеется по 0,2 мл исследуемого антигена, тщательно встряхивают и инкубируют, как описано выше.
В дальнейшем в отмытые лунки вносят по 0,2 мл антиротавирусного конъюгата в рабочем разведении при прежнем режиме взаимодействия реагентов.
На заключительном этапе в каждую лунку вносят по 0,2 мл субстратной смеси и через 40—60 минут производят учет результатов реакции.
Следует отметить, что оптическая плотность образовавшегося продукта реакции прямо пропорциональна содержанию антигена в исследуемой пробе.
При визуальной оценке результатов ИФА, интенсивность окраски лунок с экспериментальными образцами сравнивают с окраской лунок с положительным и отрицательным контролем:
-интенсивное коричневое окрашивание - положительный результат;
-коричневое окрашивание - положительный результат;
-светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;
отсутствие окрашивания - отрицательный результат.
Пробы, при исследовании которых получен сомнительный результат, подлежат повторному исследованию. В случае получения двух сомнительных результатов реакции пробу считают отрицательной.
При инструментальной регистрации результатов иммуноферментного анализа, используются плашки с плоским дном и спектрофотометры или фотоэлектроколориметры при длине волны 450 нм. Позитивным результатом считается показатель реакции с оптической плотностью, превышающей на 0,15 оптических единиц значение с отрицательным контролем.
|
|
|
Диагноз считают установленным в одном из следующих случаев:
—при выявлении вируса, выделенного из исходного вируссодержащего материала от телят с признаками патологии желудочно-кишечного тракта в культуре клеток, при наличии характерного ЦПД с последующей идентификацией в РН, РИФ, РИД, ИФА;
—при индикации характерных вирионов в исследуемом клиническом вируссодержащем материале методом иммуноэлектронной микроскопии;
—при обнаружении ротавирусных антигенов в пробах фекалий или соскобах со слизистой оболочки кишечника в РИФ, РИД, ИФА при наличии клинических и патологоанатомических показателей.
В случае выявления специфических антител при постановке диагноза учитывают наличие характерных симптомов болезни, отсутствие антител у коров-матерей как в крови, так и в молоке. С учетом указанного принимают окончательное решение по этиологии болезни.
У новорожденных телят ротавирусную инфекцию следует дифференцировать от коронавирусного энтерита, аденовирусной инфекции, вирусной диареи, эшерихиоза, парвовирусной инфекции, аназробной энтеротоксемии, а также патологии желудочно-кишечного тракта алиментарного происхождения.
|
|
|
