Периодическое культивирование

Культивирование бактерий представляет собой процесс увеличения концентрации некоторых или всех компонентов популяции. Обычно характеристики этого процесса устанавливаются путем измерений тех или иных его показателей.

Ранее более широкое применение находило культивирование микроорганизмов на поверхности плотных питательных сред. Применение жидких питательных сред позволило избежать некоторых недостатков, связанных с культивированием поверхностным способом, требуя постоянного перемешивания культуры с целью выравнивания условий роста организма в различных частях рабочего объема сосуда. Эту систему можно уже назвать динамической в отличие от описанной выше статической при стационарном культивировании.

Периодический метод культивирования предусматривает внесение посевного материала в питательную среду (инокуляция клетками среды) в начале процесса и получение культуры по достижении заданной фазы развития популяции. Концентрация микроорганизмов в периодической культуре нарастает и останавливается либо из-за лимитирования субстратом, либо из-за ингибирования токсичными продуктами жизнедеятельности. Для этого типа культивирования характерно непрерывное изменение физиологического состояния клеток, вызванное изменениями условий, производимыми жизнедеятельностью самих клеток. Отсюда следует, что периодическая система может поддерживать размножение клеток только в течение ограниченного времени. После фазы экспоненциального (логарифмического) роста популяция начинает испытывать недостаток элементов питания и угнетается продуктами метаболизма, что ведет к нарушению физиологического состояния клеток. Периодические культуры находятся в неустойчивом состоянии, что является серьезным недостатком, особенно когда их применяют при изучении свойств микроорганизмов.

Практически все системы периодического культивирования являются закрытыми, поскольку микроорганизмы в них размножаются и проходят все фазы развития без притока питательной среды и оттока культуральной жидкости.

При изучении динамики роста культур микроорганизмов необходимо строго соблюдать некоторые условия:

1) жизнеспособность засева;

2) наличие в среде культивирования всех необходимых питательных веществ;

3)отсутствие в среде ингибиторов, подавляющих рост клеток;

4) поддержание в среде оптимальными всех физико-химических условий.

В простой гомогенной периодической культуре можно выделить несколько фаз роста (рисунок 1):

 

Рис. 1. Основные фазы кривой роста периодической культуры микроорганизмов.

 

1) лаг-фаза. При внесении клеток из культуры, находящейся в стационарной фазе, в свежую среду того же состава, они приобретают способность к возобновлению роста только после определенного периода, в течение которого происходит изменение их химического состава. Продолжительность периода адаптации может быть различной, но обычно она прямо пропорциональна длительности предшествующей стационарной фазы. В свежей среде длительность лаг-фазы зависит от количества и возраста посевного материала, а также от изменений состава и концентрации питательных компонентов при внесении инокулята. Внесение небольшого количества инокулята в большой объем свежей среды может привести к диффузии из клеток витаминов, кофакторов и ионов, которые необходимы для поддержания активности многих внутриклеточных ферментов. Если клетки инокулируют из богатой среды в минимальную, то продолжительность лаг-фазы значительно зависит от объема инокулята, поскольку он содержит микроэлементы, попадающие при инокуляции в ростовую среду. Длительность лаг-фазы зависит также и от возраста инокулята. Это связано с тем, что в процессе развития в клетках накапливаются токсические вещества и недостаточно питательных веществ, необходимых для первоначального роста. Как правило, при переносе клеток из бедной среды в богатую с увеличением возраста инокулята лаг-фаза удлиняется. Наконец, изменения состава питательных компонентов, а также их концентрации при переносе инокулята в свежую среду, могут оказывать воздействие на длительность лаг-фазы, влияя на регуляцию активности ферментов и морфологическую дифференцировку клеток. Если клетки переносят с бедной среды в богатую, то питательные компоненты и время расходуются на повышение активности ферментов, необходимых для повышения активности метаболизма в целом. Если же клетки переносят с богатой среды на среду с более низким уровнем питательных веществ, то они способны немедленно, хотя и с низкой скоростью вступить в экспоненциальную фазу роста

2) фаза экспоненциального роста. Экспоненциальный рост с высокими скоростями обычно не поддерживается в микробной популяции длительное время. В норме он ограничивается вследствие исчерпания доступных источников питания или накопления токсичных продуктов обмена веществ в ростовой среде или из-за некоторых изменений в физических свойствах среды. В результате этого скорость роста снижается, и, в конечном счете, рост прекращается.

3) стационарная фаза. Изменения в физическом и химическом составе среды приводят к переходу культуры в стационарную фазу, в которой увеличения количества клеток не происходит, но клетки еще нуждаются в источниках энергии для поддержания своей жизнедеятельности. Переход из экспоненциальной фазы в стационарную включает период несбалансированного роста, когда разные клеточные компоненты синтезируются с разными скоростями. Поэтому в стационарной фазе химический состав клеток отличается от их состава в экспоненциальной фазе. Клетки меньше по размеру и менее чувствительны к физическим и химическим воздействиям. В стационарной фазе количество биомассы остается постоянным

4) фаза отмирания. К гибели клеток приводит ряд факторов, важнейшим из которых является исчерпание запасов энергии в клетке. Наблюдается резкое экспоненциальное уменьшение числа жизнеспособных клеток. Скорость отмирания зависит от видовых особенностей организма.

Для некоторых целей вполне достаточно качественной характеристики роста, т. е. простого наблюдения имеет ли место вообще рост культуры. Но для того, чтобы иметь дальнейшую более полную информацию, необходимо измерять рост количественно. Если рост периодической культуры прослеживается по увеличению бактериальной массы, то для получения точной информативной картины роста культуры клеток анализируются разные количественные параметры роста: скорость роста, экономический коэффициент, выход бактериальной биомассы, время генерации и другие.

При определении параметров роста исследуют рост простой гомогенной периодической культуры. Предполагается, что такая система состоит из хорошо перемешиваемой, засеянной питательной среды.

 

Параметры кривой роста

Под урожаем клеток (Х) понимают разность между максимальной и исходной массой бактерий: X = X_maх – Х_о. Эту величину выражают в весовых единицах, чаще в граммах.

Особенно важно отношение урожая клеток к количеству потребленного субстрата (X/S). Если обе эти величины выражают в весовых единицах, то отношение Х/S, называемое экономическим коэффициентом, обозначают через Y:

Y = dХ/dS,

где dX – увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстрата в количестве dS. Более строго экономический коэффициент определяется пределом, к которому стремится данное соотношение при dS, стремящейся к нулю. Важность экономического коэффициента состоит в том, что он выражает количественные потребности организма в пище. Впервые экономический коэффициент был использован Ролэном для выражения пищевых потребностей микроскопических мицелиальных грибов (Y = -dХ/dS). Знак «–» здесь вводился, поскольку значения изменяются в разных направлениях. В настоящее время принято использовать величину Y, обратную, предложенной Ролэном.

Если же урожай (в граммах) относят к числу молей потребленного субстрата, то экономический коэффициент, называемый в этом случае молярным экономическим коэффи ц иентом, обозначают через У_m. Молярный экономический коэффициент У_m позволяет связать урожай клеток с полученным из какого-либо источника энергии (т. е. какого-либо субстрата) количеством АТФ (макроэргические эквиваленты). У_АТФ - энергетический коэффициент, выражаемый в граммах клеточной массы на 1 моль АТФ. Этот коэффициент можно вычислить, если известен путь расщепления данного субстрата и выход АТФ в результате этого расщепления.

Скорость потребления субстрата культурой в данный момент времени выражается соотношением:

dS/dT = qX,

где X – биомасса, а коэффициент q известен как метаболический коэффициент или удельная скорость метаболизма. Метаболический коэффициент аналогичен ферментативной активности. Метаболический коэффициент можно выразить также через экономический коэффициент и удельную скорость роста и представить еще в таком виде:

q = m/Y.

 

Если удовлетворены все необходимые требования, то предполагается, что в течение единицы времени dt увеличение биомассы dX должно быть пропорционально количеству биомассы X и интервалу времени, т. е.:

dX = mХ^.dt,

откуда

dХ/dt = mХ или m = dХ/dt ^. 1/X

Дифференциальное отношение dХ/dt выражает скорость роста популяции клеток. Параметр m, обозначающий скорость роста единицы биомассы (I/Х) (dХ/dt), называется удельной скоростью роста и измеряется в единицах, обратных времени (1/t). Этот параметр аналогичен сложным процентам. Так, например, удельная скорость роста 0,1 часа эквивалентна скорости 10 % в 1 час.

Если m постоянна, то интегрирование уравнения дает:

Ln Х = Ln Х_о + mt,

где Х_o – биомасса в начальный момент времени t = 0.

Рост популяции клеток, подчиняющийся этому закону, называется экспоненциальным или логарифмическим ростом.

 

Для того, чтобы рассчитать время генерации клеток можно использовать уравнение, учитывая геометрическую прогрессию роста:

N = N_o ^. 2ⁿ, откуда lgN = lgN_o + n lg2,

Где N число клеток.

Отсюда число клеточных делений (n) составит:

n = lgN-lgN_o/lg2

 

Константа скорости деления или число клеточных делений в единицу времени t-t_o можно вычислить по формуле:

ν=n/t,

а время одной генерации (g) по формуле:

g=t/n=1/ν

 

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: