Получение протопластов у бактерий

В 1800 г. А. Фишер впервые показал явление «плазмоптиза» – выхода содержимого клеток в окружающую среду при их помещении в гипертонический раствор – для бактерий Bacillus subtilis и Vibrio proteus. При этом протоплазма обособлялась в виде шарообразных тел, очень быстро исчезающих.

Основная работа по получению протопластоподобных тел у бактерий началась в начале 50-х годов прошлого века. В эти годы с использованием гипертонических растворов различных солей было обнаружено влияние условий культивирования клеток на выход шарообразных форм. Было установлено значение концентрации шаров (чем гуще суспензия, тем интенсивнее образование шаров) и влияние рН среды (слабокислая и нейтральная реакция способствовали образованию шаров, в то время как при кислой и щелочной реакции шары не образовывались). Однако целостность полученных шарообразных форм сохранять не удавалось, они быстро лизировались.

Следующим шагом в получении протопластоподобных структур явилось ферментативное растворение бактериальной клеточной стенки при помощи гидролитического фермента лизоцима. Толчком к этому послужил установленный M. R. J. Salton факт растворения под действием лизоцима клеточных стенок грамположительных бактерий. Однако и в этих экспериментах протопластоподобные тела оказывались очень неустойчивыми.

Этого удалось избежать С. Weibull, который обрабатывал бакте-риальные клетки лизоцимом в гипертоническом растворе сахарозы. Полученные им сферические тела долгое время сохраняли свою целостность при условии помещения их в среду со стабилизатором осмотического давления. С. Weibull назвал полученные сферические образования протопластами, употребив термин, применявшийся ранее в цитологии растений.

Установлено, что на активность лизоцима могут оказывать влияние вещества, используемые в качестве стабилизаторов осмотического давления. Например, использование 0,5 % NaCl тормозит действие лизоцима на клетки. Лучшими стабилизаторами для получения бактериальных протопластов считаются углеводы. Чаще всего применяют 0,1 – 0,6М растворы сахарозы, глюкозы, раффинозы, мелибиозы, трегалозы.Иногда используют и более высокие концентрации сахаров.

Для получения протопластов грамположительных бактерий достаточна простая обработка клеток лизоцимом в гипертоническом растворе. Под действием этого фермента растворяется ригидный пептидогликановый слой клеточной стенки. При этом чувствительность к лизоциму не одинакова не только у разных видов бактерий, но и среди разных штаммов.

Для получения протопластов грамотрицательных бактерий простая обработка лизоцимом малоэффективна. В клеточных стенках этих бактерий тонкий слой пептидогликана окружен внешним слоем, состоящим из лигопротеинов, фосфолипидов, липополисахаридов, что делает его недоступным действию лизоцима. Для проникновения фермента к субстрату необходимо нарушение поверхностных слоев клеточной стенки.

Подготовка клеток грамотрицательных бактерий для воздействия лизоцимом проводится с помощью различных методов, повышающих чувствительность клеток: путем предварительной инкубации бактерий в жидкой питательной среде при щелочном рН или в присутствии высоких концентраций сахарозы; обработка клеток хелатирующими соединениями (например, Na-ЭДТА) или одно- и дивалентными катионами; применение предварительного замораживания-оттаивания.

Наиболее удачным оказался метод, предложенный Р. Репаске и до сих пор применяемый для получения протопластов у разных видов грамотрицательных бактерий. Автор показал возможность получения протопластов при совместном действии лизоцима и ЭДТА в среде с рН 7,6-8,0.

В 1976 г. Р. Вейсс предложил ускоренный метод получения протопластов кишечной палочки с использованием ЭДТА, модифицировав метод Репаске. Он применил не совместное действие на клетки лизоцима и ЭДТА, а последовательное

Вместо лизоцима в качестве факторов, лизирующих клеточные стенки бактерий, можно использовать также литические ферменты микробного происхождения.

Вторая группа методов получения протопластов у бактерий предусматривает не разрушение готовых клеточных стенок, а ингибирование их синтеза (методы «несбалансированного роста»). Метаболические нарушения при синтезе клеточных стенок происходит в двух случаях: 1) в результате мутации может возникнуть генетический блок в цепи реакций, ведущих к синтезу полимеров клеточной стенки; 2) при нарушении синтеза клеточной стенки под действием агентов, предотвращающих образование ригидного мукополимера.

Целостность клеточных стенок у некоторых бактерий зависит от наличия в ростовой среде мукополимерных аминокислот - ДАП, цистеина, аланина, лизина, глицина, орнитина, и глутаминовой кислоты. Когда они исчерпываются в процессе роста клеток, синтез клеточных стенок приостанавливается (Streptococcus faecalis).

Одним из широко распространенных методов получения протопластов у грамотрицательных бактерий является так называемый пенициллиновый метод, основанный на свойстве пенициллина нарушать синтез пептидогликана. (Впервые предложен К. Ледермейстером и Е. Келленбергером в 1956 г.). Пенициллиновый метод не эффективен в тех случаях, когда в клетках подавлен синтез активных цитоплазматических компонентов, например при воздействии на клетки хлорамфениколом, стрептомицином или хлортетрациклином. Действие пенициллина на активно растущие клетки сводится к торможению реакции транспептидирования на последней стадии синтеза пептидогликана, после того как этот полимер почти построен.

Для получения протопластов грамположительных бактерий пенициллиновый метод непригоден. Объясняется это тем, что мукополимерный слой в клеточной стенке этих бактерий не защищен дополнительными слоями, как у грамотрицательных бактерий, и при культивировании с антибиотиком клетки претерпевают лизис. Однако имеются отдельные сообщения об успешном применении метода для получения протопластов у Corynebacterium glutamicum, для которых другие методы были неэффективны.

Помимо указанных способов, протопласты у бактерий могут быть получены и другими методами: под влиянием глицина, фагового литического фермента, нормальной и иммунной сывороток, комплимента, методом автолиза и т. д.

Протопласты, полученные из грамотрицательных и грамположительных бактерий, по качеству оставшихся поверхностных структур различаются между собой. У протопластов грамположительных бактерий клеточная стенка отсутствует полностью, и их сферические тела окружены лишь цитоплазматической мембраной. Сферические тела грамотрицательных бактерий сохраняют значительную часть сложноорганизованной клеточной стенки и называются сферопластами.