как носителей генетической информации 7 глава

В заключение остановимся на превращении кольцевых хромосом, доля которых при некоторых мутагенных воздействиях, например при облучении клеток растений и млекопитающих в фазе G₁, довольно значительна. Судьба кольцевых хромосом, как центрических, так и ацентрических, зависит от сестринских хроматидных обменов (СХО), регулярно осуществляющихся в фазах S и G₂. Если СХО между палочковидными, обычными хромосомами не изменяют их форму, то аналогичный процесс между кольцевыми хромосомами может иметь различные последствия. В результате СХО кольцевые хромосомы могут превращаться в дицентрические кольца и палочковидные хромосомы, причем разрывы колец в последнем случае будут распределены по хромосоме случайно. Следовательно, в таких клетках при каждом разрыве кольца разные гены будут занимать положение, ближайшее к точке разрыва, и испытывать эффект положения.

Различия в чувствительности к радиации регистрируется не только на уровне организмов, но и отдельных типов клеток. Так, сперматозоиды дрозофилы намного чувствительней к мутагенному действию рентгеновских лучей, чем сперматогонии и особенно ооциты. Больше всего мутаций индуцируется в дробящихся яйцах. Эти различия, отмеченные и для многих других организмов, могут быть связаны с особенностями состояния ДНК (степень спирализации хромосом, плотность их упаковки в ядре и др.) и митотической активности клеток разных типов с неодинаковым содержанием воды в их протоплазме, влияющим на возникновение свободных радикалов и перекисей, с различиями в их репарационной способности.

Таким образом, индуцируемый радиацией мутагенез зависит от следующего: 1) дозы и характера облучения; 2) особенностей организма; 3) типа облученных клеток; 4) условий среды в момент облучения и после него; 5) физических особенностей разных видов ионизирующих облучений; 6) типа повреждений ДНК и 7) эффективности систем их репарации.

Несмотря на обилие данных, молекулярный механизм радиационного мутагенеза не вполне ясен. Известно, однако, что рентгеновское облучение приводит к разрыву водородных связей в двойной спирали ДНК, одно- и двухцепочечным разрывам ДНК, сшивкам между двумя цепями ДНК, между различными молекулами ДНК и между ДНК и белком. Двойные разрывы ДНК у прокариот преимущественно летальны. Недавние исследования, главным образом на E. coli, выявили три механизма репарации одноцепочечных разрывов, вызванных ионизирующим излучением. Различия между ними определяются временем, необходимым для устранения повреждения, которое колеблется в зависимости от типа репарации и условий среды обитания облученных клеток от 2 до 60 мин. Имеются данные и о возможности репарации разрывов обеих цепей ДНК, в осуществлении которой, как показано С.В. Шестаковым с сотрудниками, участвуют рекомбинационные механизмы.

 

Мутагенное действие ультрафиолетовых лучей

 

Способность ультрафиолетовых (УФ) лучей вызывать мутации была обнаружена в начале 30-х годов в исследованиях на дрозофиле и цветковых растениях. В отличие от рентгеновских, УФ-лучи не обладают достаточной энергией для индукции ионизации атомов. Однако они поглощаются входящими в состав ДНК пуринами и пиримидинами, переводя их в возбужденное состояние. Экспериментальная работа с УФ-лучами связана с определенными трудностями, поскольку они слабо проникают внутрь тканей у многоклеточных организмов, задерживаясь в поверхностных слоях клеток. Тем не менее, УФ-лучи довольно сильный физический мутаген, особенно для одноклеточных организмов. ДНК максимально адсорбирует УФ-лучи с длиной волны 254 нм. Эта же величина соответствует максимуму мутагенности УФ-лучей, что указывает на прямую связь процесса индукции предмутационных повреждений ДНК с поглощением УФ-лучей ее азотистыми основаниями.

Подобно большинству мутагенов, УФ-лучи индуцируют в ДНК не мутации, а только предмутационные повреждения. Для того чтобы такие повреждения преобразовались в мутации, они должны закрепиться, или фиксироваться, т.е. привести к определенному изменению последовательностей оснований в ДНК. В результате поглощения УФ-лучей с длиной волны 254 нм наиболее реактивными становятся пиримидины, в ответ на облучение образующие два типа фотопродуктов - гидраты и димеры. Основные продукты при облучении двухцепочечной ДНК - пиримидин-пиримидиновые, преимущественно тимин-тиминовые димеры, формирующие между соседними основаниями в цепи ДНК циклобутановое кольцо. Такие димеры рассматриваются как предмутационные повреждения, индуцированные УФ-лучами. Их разрушение в результате фотореактивации устраняет до 90% случаев мутагенеза, связанного с включением ошибочного основания против поврежденного участка. Присутствие димеров в ДНК приводит к ошибкам при ее репликации. Наряду с этим осуществляющееся в ходе репликации УФ-повреждений вырезание димеров из ДНК и восстановление целостности ее структуры также может привести к ошибкам. Сравнительно недавно обнаружен еще один тип повреждений ДНК, индуцированных УФ-лучами, - пиримидин-пиримидин (6-4) УФ-фотопродукты. Они образуются в форме димеров между тимином и цитозином в УФ-облученной ДНК в количестве ¹/₁₀ от общего числа димеров пиримидина, однако скорость их формирования в определенных последовательностях ДНК выше, чем циклобутановых димеров. Такие последовательности являются одновременно “горячими точками” образования (6-4) УФ-фотопродуктов и индуцированных УФ-лучами замен пар оснований типа транзиций, ведущих к появлению амбер (УАГ)-, охра (УАА)- и опал (УГА)-кодонов в соответствующем участке иРНК. Отсюда сделано заключение, что (6-4) УФ-фотопродукты наряду с димерами пиримидинов представляют собой один из типов предмутационных повреждений, индуцируемых в ДНК УФ-лучами.

 

Мутагенное действие химических соединений

 

Химический мутагенез был открыт в 30-х годах работами В.В. Сахарова, М.Е. Лобашева и др., обнаруживших, что некоторые соединения (йод, марганцевокислый калий, аммиак, уксусная кислота, сульфат меди) способны индуцировать летальные мутации у дрозофилы. В 1939 г. С.М. Гершензон установил, что добавление ДНК из тимуса теленка в корм личинок дрозофил индуцирует у них видимые мутации. Широкое изучение химического мутагенеза началось после того, как в 1946 г. И.А. Рапопорт (в СССР) обнаружил мощное мутагенное действие этиленамина и формальдегида, а Ш. Ауэрбах (в Англии) - иприта и его производных. С тех пор было выявлено много химических соединений, которые по своей мутагенной активности могут быть разделены на два класса: 1) соединения, мутагенные в отношении как реплицирующейся, так и нереплицирующейся (покоящейся) ДНК: алкилирующие соединения, гидроксиламин и азотистая кислота; 2) соединения, мутагенные только в отношении реплицирующейся ДНК: аналоги оснований, структурно напоминающие нормальные пурины и пиримидины в ДНК, а также акридиновые красители.

Рассмотрим вкратце механизм и особенности мутагенного действия некоторых из этих соединений.

 

Мутагены, действующие на

покоящуюся и реплицирующуюся ДНК

 

Алкилирующие агенты. Известны 9 классов алкилирующих агентов, различающихся по типу алкильных групп (СН₃-метильной, С₂Н₅-этильной и более сложных), которые они переносят на биологически важные макромолекулы, включая ДНК, и по числу алкильных групп, которые может отдавать одна молекула алкилирующего агента. Последнее свойство характеризует функциональность соединения, причем “полифункциональными” называют все алкилирующие агенты, у которых число алкильных групп больше единицы. Степень функциональности определяется особенностями соединения, а не только числом алкильных групп. Так, несущий две метильные группы метилметансульфонат СН₃ОSOСН₃, способен отдавать только одну из них, поэтому относится к монофункциональным.

Механизм мутагенного и летального действия многих алкилирующих агентов не вполне ясен. Известно, однако, что при действии соединений из группы нитрозоалкиламинов (нитрозонитроалкилгуанидина, алкилнитрозомочевины) основным предмутационным изменением в ДНК является образование О⁶-алкилгуанина, а гибель клеток вызывается преимущественно образованием 3-алкиладенина и 3-алкилгуанина. Вместе с тем наиболее часто алкилированию подвергается атом азота в 7-ом положении гуанина. Например, 98% всех повреждений ДНК, индуцированных метилметансульфонатом, составляют метилированные основания, среди которых на долю N⁷-мелтилгуанина приходится 84%. Тем не менее мутагенный эффект этого алкилирующего агента непосредственно не связан с присутствием в ДНК модифицированных оснований, а обусловлен индукцией системы ошибающейся репарации ДНК.

Главное следствие мутагенного действия алкилирующих агентов - появление мутаций типа транзиций ГЦ®АТ. Кроме того, в результате ошибок репарации могут возникать мутации типа транзиций АТ®ГЦ, трансверсий и сдвига рамки считывания. Некоторые, особенно бифункциональные алкилирующие агенты, например азотистый иприт или антибиотик митомицин С, вызывают поперечные сшивки цепей молекул ДНК, приводящие к разрывам хромосом и, как следствие, к хромосомным аберрациям.

Мутагенное действие некоторых нитрозосоединений (диэтилнитрозомочевины, нитрозометил- и нитрозоэтилмочевины и др.) столь значительно, что общая частота вызываемых ими мутаций может достигать 100%. Из этих соединений часто используется N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин (сокращенно нитрозогуанидин), способный индуцировать мутации в участках хромосомы E. coli, которые в момент обработки мутагеном находятся в репликативной вилке. На дрозофиле же этот мутаген вызывает генные мутации и перестройки в сперматозоидах, в которых репликации ДНК не происходит. Нитрозоалкилмочевины нашли широкое применение в селекции растений.

В механизме разрывов цепи ДНК под действием алкилирующих агентов важная роль принадлежит процессу возникновения “апуриновых брешей”, возникающих вследствие ослабления связей между алкилированным гуанином либо (реже) аденином и сахарофосфатным остовом, ведущего к постепенному выпадению пурина из алкилированной ДНК. На место выпавшего пурина в образовавшийся апуриновый сайт может встроиться какое-либо другое основание, что ведет к возникновению генной мутации.

Отмечено сходство генетических эффектов между алкилирующими агентами и рентгеновскими лучами. Поэтому иприт и близкие к нему соединения иногда называют “радиомиметиками” (от греч. “mimetes”-подражатель). Действительно, многие алкилирующие агенты, как и рентгеновские лучи, вызывают доминантные, сцепленные с полом летали и видимые мутации, крупные и мелкие делеции, инверсии и транслокации. Подобно рентгеновским лучам, химические радиомиметики способны индуцировать кроссинговер в соматических и половых клетках.

Доказательства существования замедленного мутагенеза и нестабильности, связанных с действием алкилирующих агентов, были получены при анализе мозаичных мутантов у дрозофилы и дрожжей. У таких мутантов часть клеток является мутантной по определенному признаку, а другая часть сохраняет по тому же признаку дикий фенотип. Способность вызывать мозаичные мутации присуща всем мутагенам, как физическим, так и химическим. Образование мозаик непосредственно связано с молекулярным механизмом индуцированного мутагенеза. Известно, что в каждом данном сайте предмутационные изменения затрагивают одну или обе цепи дуплекса ДНК. Фиксация таких потенциальных мутационных повреждений связана с репликацией. При репликации ошибка в одной цепи ДНК ведет к формированию мутагенного клона, тогда как другая, нормальная, цепь обеспечивает правильный матричный синтез комплементарной цепи и образование клона дикого типа. Как же в таком случае можно объяснить факт образования полных мутаций? Для объяснения этого явления предложена репарационная гипотеза, согласно которой в клетках имеется какой-то фермент, способный удалить ошибочное основание до первой репликации, т.е. до момента фиксации мутации. В зависимости от того, какая из цепей ДНК подвергается коррекции в ходе последующего репаративного ресинтеза, а затем и вегетативной репликации, возникнут чистые клоны мутантного или дикого типа. При отсутствии коррекции появится смешанный клон. Известно, однако, что репаративные ферменты могут различать поврежденную и интактную цепи ДНК.

Гидроксиламин. В отличие от большинства алкилирующих агентов гидроксилирующий агент гидроксиламин NH₂OH обладает строго специфичным мутагенным действием. Он индуцирует преимущественно транзиции ГЦ®АТ. Механизм мутагенности гидроксиламина не вполне ясен, однако известно, что он предпочтительно взаимодействует с цитозином, присоединяя к нему аминогруппу. Такой модифицированный цитозин способен ошибочно спариваться с аденином, что и ведет к образованию транзиции ГЦ®АТ. Ввиду своей специфичности гидроксиламин часто используется для определения типа транзиции, вызванной другими мутагенами. Например, мутанты, возникшие в результате транзиций, могут быть разделены на два класса в зависимости от способности ревертировать под действием гидроксиламина. Очевидно, те из них, которые содержат в мутантном сайте пару АТ, не ревертируют. Напротив, если мутация привела к замене оснований типа АТ®ГЦ, то она будет ревертировать.

Поскольку гидроксиламин способен действовать на покоящуюся ДНК, он эффективно используется в качестве агента индуцирующего in vitro мутации в трансформирующей ДНК бактерий либо у внеклеточных бактериофагов. Мутагенное действие гидроксиламина на эукариотические организмы выражено слабо.

Азотистая кислота. Азотистая кислота HNO₂ - сильный мутаген, действующий путем окислительного дезаминирования оснований, содержащих аминогруппы (гуанин, аденин, цитозин). Замещение аминогруппы кетогруппой превращает аденин в гипоксантин, спаривающийся преимущественно не с тимином, а с цитозином. Дезаминирование цитозина превращает его в урацил, спаривающийся с аденином. Дезаминирование гуанина переводит его в ксантин, однако это не нарушает специфичности спаривания, т.к. оба они образуют водородные связи с цитозином. Первые два типа дезаминирования ведут к транзициям АТ®ГЦ и ГЦ®АТ соответственно. Поскольку азотистая кислота индуцирует транзиции в обоих направлениях, вызываемые ею мутации способны ревертировать при повторной обработке тем же мутагеном.

Помимо замен оснований азотистая кислота индуцирует делеции, что обусловлено ее способностью к поперечному сшиванию цепей ДНК. У эукариот мутагенное действие азотистой кислоты, по-видимому, также связано с вызываемыми ею сшивками между ДНК и гистоном. Показана мутагенность азотистой кислоты в отношении различных бактерий, бактериофагов, РНК-вых вирусов, грибов. In vitro азотистая кислота индуцирует мутации в трансформирующейся ДНК, но по эффективности уступает в этом отношении гидроксиламину.

 

Мутагены, действующие

на реплицирующуюся ДНК

 

Аналоги оснований - это соединения, имеющие сходную с нормальными азотистыми основаниями кольцевую структуру, отличающиеся от них по химическим свойствам. Некоторые из аналогов оснований, например аналог тимина 5-бромурацил (5-БУ) и аналог пурина 2-аминопурин (2-АП), - сильные мутагены. Механизм мутагенного действия аналогов оснований связан с их более выраженной по сравнению с нормальными основаниями способностью к таутомерным переходам: из нормальной кетоформы в редкую энольную форму (у пиримидинов) и из нормальной аминоформы в редкую иминоформу (у пуринов). Находясь в кетоформе, 5-БУ спаривается с аденином, а в энольной форме - с гуанином. Точно так же 2-АП в аминоформе, подобно аденину, спаривается с тимином, а в иминоформе - с цитозином.

Различают два механизма мутагенного действия аналогов оснований: ошибки включения и ошибки репликации. В случае ошибок включения 5-БУ в редкой энольной форме спаривается с гуанином в матричной цепи, а затем уже в ходе следующего цикла репликации, перейдя в обычную кетоформу, спаривается с аденином. В третьем цикле репликации аденин нормально спаривается с тимином и таким образом происходит транзиция ГЦ®АТ. Сходные рассуждения в отношении 2-АП показывают, что при его ошибочном включении появится транзиция того же типа.

В случае ошибок репликации 5-БУ, первоначально находящийся в кетоформе, как и тимин, нормально спаривается с аденином. При переходе в энольную форму 5-БУ уже в следующем периоде репликации соединится с гуанином. Последний в третьем цикле репликации спарится с цитозином, что обеспечит возникновение транзиции АТ®ГЦ. Легко видеть, что такая же транзиция произойдет, если в результате ошибки репликации 2-АП заменит аденин и спарится с тимином. Таким образом, оба механизма возникновения мутаций под действием 5-БУ или 2-АП связаны с заменой пар оснований, происходящей через три цикла репликации. Различия между ними состоят в том, что ошибка включения проявляется сразу, а ошибки репликации возникают в любом из ее циклов, когда уже включившийся аналог перейдет в более редкую таутомерную форму. Фиксация этого предмутационного события происходит еще через два цикла репликации и ведет к возникновению стабильной мутации. Для того чтобы произошла ошибка включения, аналог основания должен присутствовать в среде, а ошибка репликации может произойти позднее, когда аналог будет удален из среды, например, с помощью отмывки от нее мутагенизируемых клеток.

Помимо описанного прямого действия аналоги оснований могут увеличивать чувствительность молекул к другим мутагенам (например, 5-БУ делает ДНК более чувствительной к УФ-лучам и ионизирующим излучениям).

Замечено, что замены нормальных оснований, индуцированные действием их аналогов, зависят от локализации первых в нуклеотидной цепи. Так, в rII области фага Т4 обнаружены “горячие точки”, в которых 2-АП и 5-БУ особенно часто вызывают замены оснований. Как уже отмечалось, частота, с которой аналог оснований вызывает ту или иную транзицию в данном сайте, зависит от соседних с ним оснований. На основе этого сделан вывод о том, что мутагенное действие аналога определяется не самим основанием, а его положением в нуклеотидной цепи.

Акридины. Акридиновые красители - акридин оранжевый, акрифлавин, профлавин, а также алкилированные акридины (ICR-170, ICR-191) обладают мощным мутагенным действием, индуцируя сдвиги рамки считывания (фреймшифт-мутации). Положительно заряженные молекулы акридинов, имеющих сходные с основаниями кольцевые структуры, но лишенные сахарофосфата, вставляются между “стопками” пар оснований в ДНК. Это приводит к нарушению конформации дуплета ДНК. Генетические исследования показали, что самой такой вставки акридинов недостаточно для возникновения мутаций: в этом процессе участвует рекомбинация или репарация ДНК. Предложена модель, объясняющая возникновение мутаций сдвига рамки под действием акридинов вставками или выпадениями оснований в результате формирования одноцепочечных петель ДНК в участках, содержащих повторяющиеся пары оснований. Возникновение петли вследствие внедрения акридинов в места с такими повторами приводит к удлинению или укорочению образующейся в ходе репликации цепи ДНК на одну пару оснований. Мутанты, не способные ревертировать под действием соединений, индуцирующих замены оснований, но ревертирующие под действием акридина, классифицируют как мутанты со сдвигом рамки считывания. Использование акридинов способствовало установлению триплетной природы генетического кода.

К мутагенам также, помимо уже рассмотренных 5-БУ и 2-АП, относятся азотистая кислота, гидроксиламин, этилметансульфонат, N-метил-N¢-нитро-N-нитрозогуанидин, метилметансульфонат, акридины, УФ-лучи, а также рентгеновские лучи.

Кроме того, в качестве мутагенов используют и другие химические соединения, отличающиеся друг от друга по механизму действия. Например, известны мутагены, имитирующие действие УФ-лучей. К ним относится 4-нитрохинолин-1-оксид, эффективно реагирующий с ДНК лишь после активации клеточными ферментами. Мутагенное действие формальдегида, взаимодействующего как с нуклеотидами в ДНК, так и с нуклеопротеином, обусловлено образованием сшивок между ДНК и белком. Соединения, относящиеся к группе фотосенсибилизирующих мутагенов, образуют ковалентные связи с ДНК только при возбуждении их светом с длиной волны 340-360 нм. Пример таких соединений - псорален, индуцирующий межнитевые сшивки ДНК и тем тормозящий ее репликацию.

К мутагенным факторам относятся и многие вирусы человека, животных и растений, а также некоторые бактериофаги. Показано, например, что вирус SV40 вызывает в культуре клеток человека и обезьян генные мутации и хромосомные перестройки. Предполагается, что мутагенность вирусов обусловлена их ДНК. Работами С.М. Гершензона и других авторов установлено, что введение в организм дрозофилы препаратов ДНК, выделенных из тканей млекопитающих, птиц, рыб, насекомых, а также из вирусов, вызывает большое число генных мутаций и микроделеций, тогда как крупные перестройки полностью отсутствуют. Еще одна особенность мутагенного действия ДНК состоит в том, что частота мутаций в некоторых генах увеличивается в 100-1000 раз, другие же гены либо вовсе не мутируют под действием экзогенной ДНК, либо мутируют слабо. Это означает, что в отличие от всех рассмотренных мутагенов, мутагенный эффект ДНК избирателен в отношении определенных генов, т.е. имеет черты направленного мутагенеза. Наконец, третья особенность мутагенного действия препаратов ДНК - его выраженная продленность, поскольку мутации индуцируются не только в F₁ мух, получавших ДНК с кормом, но и во многих последующих поколениях. Мутагенность чужеродной ДНК показана и на других объектах - кукурузе, микроорганизмах. Механизм этого эффекта препаратов ДНК не установлен, но предполагается, что фрагменты экзогенной ДНК могут проникнуть в половые клетки и включиться в их хромосомы.

 

Специфичность и направленность

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: