Фактор стимуляции митоза. Циклины.

Расшифровка регуляции процессов клеточного деления началась в 70-е годы прошлого века, когда были найдены методы слияния разных клеток, методы получения гетерокарионов. Оказалось, что можно получить слияние не только интерфазных клеток с интерфазными, но и интерфазных с митотическими клетками. При этом обнаружилось удивительное явление: в такой гибридной клетке, где были митотические хромосомы одной из исходных клеток, в ядрах от интерфазных клеток начиналась конденсация хромосом, разрушалась ядерная оболочка и образовывались так называемые преждевременно конденсированные хромосомы (ПКХ, или РСС — preliminary condenced chromosomes). Причем структура ПКХ зависела от стадии интерфазного ядра: в ядре от: G₁-клетки появлялись однонитчатые длинные ПКХ, в ядре от G₂-клетки ПКХ были двойными (так как после S-периода хромосомы удвоились). Эти наблюдения наводили на мысль, что при слиянии таких клеток на интерфазные ядра действуют какие-то факторы, содержащиеся в митотических клетках. Для проверки этого предположения были поставлены опыты со слиянием клеток на разных стадиях клеточного цикла, что представлено ниже.

Эти эксперименты были дополнены тем, что часть цитоплазмы митозной клетки инъецировали в цитоплазму G₁-интерфазной клетки. Это приводило к появлению в ядре интерфазной клетки ПКХ. Из этих наблюдений был сделан ввод о том, что в цитоплазме митотической клетки есть фактор (или факторы), стимулирующие митоз (ФСМ, или MPF - mitosis promoting factor). Этот фактор вызывает не только конденсацию хромосом, но и приводит к распаду ядерной оболочки, т.е. переводит интерфазную клетку, даже без синтеза ДНК, в митотическое состояние (конечно, дальше появления конденсированных хромосом развитие митоза не идет).

Параллельно с этими наблюдениями были проведены эксперименты на созревающих и дробящихся яйцеклетках лягушек X. laevis (рис. 346).

Рис. 346. Обнаружение фактора стимуляции созревания (MPF) ооцита Xenopus а — нормальное развитие: 1 — ооцит на стадии профазы I деления, 2 — ооцит на стадии I метафазы, 3 — ооцит на стадии II метафазы, 4 — зигота, 5 — I деление дробления; ПР — стимуляция прогестероном; ОП — оплодотворение; б — инъекция цитоплазмы из неделящейся яйцеклетки в такую же не вызывает созревания - перехода в метафазу; в — инъекция цитоплазмы из метафазной клетки в неделящуюся индуцирует ее переход в метафазу (созревание ооцита)

Ооцит X. laevis после репликации ДНК и короткой G₂-стадии переходит в мейотическую профазу I, во время которой в течение восьми месяцев происходят рост и созревание ооцита, он дорастает до размера зрелой икринки. При спаривании овариальные клетки самки выделяют гормон прогестерон, который стимулирует переход из профазы и I мейотическое деление (митоз I), затем после короткой интерфазы наступает II мейотическое деление, которое на некоторое время останавливается на стадии метафазы (стадия яйца). При оплодотворении спермием метафаза завершается, происходит второе деление меойза, после чего гаплоидное ядро яйцеклетки сливается с ядром спермия и образуется диплоидная зигота. После этих событий следуют через каждые 30 мин многочисленные деления клеток развивающейся бластулы (см. рис. 346, а).

Если взять с помощью микроманипулятора небольшую часть цитоплазмы из ооцита на стадии метафазы II мейотического деления и инъецировать ее в цитоплазму не стимулированного прогестероном ооцита, то произойдет повторение описанного выше процесса: ооцит вступит в I деление мейоза, а затем и во II деление, т.е. произойдет его созревание (см. рис. 346, в). Таким образом было найдено, что в ооците на стадии метафазы II деления в цитоплазме существует фактор (или факторы), стимулирующий созревание яйцеклетки (ФСС, или MPF — maturation promoting factor).

Оказалось, что этот фактор (будем называть его MPF) присутствует в клетках только во время митотического состояния. Он обнаруживается также и во время дробления яйцеклетки (рис. 347). Таким образом, уровень MPF в интерфазных клетках низкий, а в митотических высокий.

Рис. 347. Колебание уровня фактора стимуляции созревания (MPF) в процессе мейотических и митотических делений при созревании и дроблении яйцеклетки Xenopus ПР — стимуляция прогестероном; ОП — оплодотворение. I — метафаза I мейотическот деления; II — длительная метафаза II мейотического деления. 1, 2, 3 — деления дробления зиготы

Далее было найдено, что при инъекции цитоплазмы из митотических клеток культуры ткани в нестимулированный ооцит X. laevis происходит созревание ооцита. Следовательно, фактор, стимулирующий митоз, и фактор, стимулирующий созревание ооцитов, - одно и то же.

Этот фактор — MPF, был выделен и охарактеризован. Это гетеродимерный комплекс, состоящий из белка циклина (см. далее) и зависимой от циклина протеинкиназы (cyclin dependent kinase — Cdk), фермента, относящегося к фосфорилазам, который модифицирует белки, перенося фосфатную группу от АТФ на аминокислоты серин и треонин. Следовательно, MPF состоит из двух субъединиц: каталитической (Cdk) и регуляторной (циклин) (рис. 348).

Рис. 348. Структура фактора, стимулирующего митоз (MPF) 1 — циклин; 2 — зависимая от циклина неактивная протеинкиназа; 3 — активный MPF

Циклины

Циклин был обнаружен при изучении включения меченых аминокислот в синхронно дробящиеся яйца морского ежа. В одном из белковых пиков на электрофореграммах метка периодически то появляется, то исчезает: она появлялась после клеточного деления, постепенно возрастала к митозу, а затем ее уровень падал после анафазы, и по том снова начинал возрастать в следующей интерфазе. Этот белок был назван циклином. Он постоянно синтезируется в течение эмбрионального клеточного цикла и резко разрушается при вступлении в анафазу. Подобный митотический циклин В был обнаружен у всех эукариот, в том числе и у X. laevis.

В раннем эмбриогенезе, т.е. при дроблении яиц X. laevis, первые 12 делений идут друг за другом при минимальной величине G₁- и G₂-периодов, и возрастание уровня MPF происходит во время каждого деления. Интересно, что дробление яиц и циклические изменения активности MPF осуществляются также без участия ядер. Это значит, что для появления активности MPF не нужна транскрипция информационных РНК. В этот период все клеточные белковые синтезы идут на долгоживущих матричных РНК, синтезированных еще во время роста ооцитов в мейотической профазе.

Расшифровка природы активности MPF была получена на модельных экспериментах с использованием цитоплазматических экстрактов активированных яиц X. laevis. В этих экстрактах были все компоненты для поддержания клеточного цикла: ферменты и предшественники для синтеза ДНК, гистоны и другие белки и липиды для образования ядерной оболочки, так же как и иРНК, необходимая для синтеза белков, и в том числе циклина В.

Если к такому экстракту добавить хроматин из спермиев X. laevis, то вокруг хроматина образуется ядерная оболочка, затем происходит синтез ДНК, конденсация хромосом, разрушается ядерная оболочка, образуется митотическая фигура и потом наступает интерфаза, цикл повторяется через каждые 20 мин. По мере прохождения каждого цикла сначала в интерфазе нарастал циклин В параллельно возрастанию активности MPF. В митозе после анафазы количество циклина В и активность MPF падали, т.е. наблюдалось циклическое изменение двух параметров (рис. 349). По мере возрастания уровня MPF при повышении активности Cdk происходила конденсация хромосом за счет фосфорилирования конденсинов и гистона H1, распад ядерной оболочки при фосфорилировании ламинов, образование веретена деления, т.е. все атрибуты митотического аппарата.

Рис. 349. Динамика MPF и циклина в цитоплазматических экстрактах ксенопуса а — циклические возрастания уровней MPF (2) и циклина В (3) после активации хроматина спермием (ХР), при этом в экстракте образуются митотические фигуры (1); 6 — РНКазная деградация иРНК в экстракте приводит к исчезновению цикличности MPF и циклина В; в — добавление к экстракту новой иРНК циклина В (показано стрелкой) возобновляет характерную динамику циклирования MPF

Деградация циклина В в анафазе вызывается сложной цепочкой белковых взаимодействий, которые приводят к его расщеплению с помощью сложных белковых протеолитических комплексов — протеосом. Кроме того, в начальных этапах деградации циклина участвует сложный белковый комплекс АРС (комплекс, стимулирующий анафазу), который не только подготавливает циклин к деградации, но одно временно приводит к деградации когезинов, удерживающих хроматиды друг с другом вплоть до анафазы.

Общая схема регуляции митотического циклина В и MPF и циклирующих клетках может быть представлена на рис. 350.

Рис. 350. Регуляция митотического циклина в постоянно делящихся (циклирующих) клетках эмбрионов Циклин В (С) и циклинзависимая протеинкиназа (Cdk) образуют фактор, стимулирующий митоз (MPF). 1 — метафаза; 2 — полиубикитинизация циклина В; 3 — его деградaция; 4 — поздняя анафаза; 5 — телофаза; 6 — интерфаза; 7 — новый синтез циклина В; 8 — профаза; 9 — неактивный белковый комплекс, стимулирующий анафазу; 10 — его активация