 |
Метод светлого поля и его разновидности
|
|
|
|
|
| Рис. 8. Зафиксированная окрашенная (Кумасси синий) клетка. Избирательное окрашивание белков цитоскелета. |
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.
Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.
Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд, костной ткани. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.
|
|
|
Оптический, или световой микроскоп использует видимый свет, проходящий через прозрачные объекты, или отражённый от непрозрачных. Оптическая система из нескольких линз позволяет получить кажущееся увеличенное изображение образца. Полученное изображение можно наблюдать глазом (или обеими глазами, в бинокуляре), либо фотографировать, передавать на видеокамеру для оцифровки.
Некоторые специальные приемы оптической микроскопии.
|
| Рис.9 |
1. Микропроекция и микрофотография. Мнимое изображение в микроскопе обусловлено тем, что промежуточное действительное изображение, образуемое объективом, располагается ближе переднего фокуса окуляра. Если это условие нарушить, например, передвинуть окуляр так, что изображение, которое дает объектив, окажется дальше фокусного расстояния окуляра (рис. 9), то последний будет давать действительное изображение, которое может быть спроецировано на экран или фотопленку. Окуляр при этом служит проекционной линзой. Аналогичные результаты можно получить, смещая весь тубус относительно предмета. Наконец, можно удалить окуляр и проецировать на экран или фотопленку действительное изображение, даваемое только объективом, хотя при этом будет реализовано значительно меньшее увеличение.
Наблюдение на экране действительного изображения предмета, полученного одним из указанных способов, называется микропроекцией. Микроскоп в этом случае ставят горизонтально и предмет освещают сильным источником света.
Фотографирование полученного таким образом действительного изображения называется микрофотографией. Обычно для этого употребляется специальная фотонасадка к микроскопу, которая (рис. 10) представляет собой фотокамеру, надеваемую на окулярный конец тубуса Т микроскопа М. Изображение предмета проецируется на плоскость расположения фотопластинки Ф. Насадка снабжена вспомогательным микроскопом с призмой П для наблюдения в процессе подготовки к съемке.
|
|
|
Рис.10 Рис.11
2. Определение величины предмета. Определение величины микроскопируемого предмета делается с помощью нанесенных на стеклянную пластинку масштабных шкал, называемых окулярный (рис. 11,а) и объектным (рис. 11,б) микрометрами.
Окулярный микрометр Мок помещают между линзами окуляра так, чтобы его шкала находилась в плоскости промежуточного изображения, образуемого объективом. В окуляр наблюдается изображение шкалы, совмещенное с изображением микроскопируемого предмета А'Б' (рис.12). Учитывая цену деления шкалы микрометра, можно определить размер этого изображения, даваемого объективом, а разделив полученные данные на известное увеличение объектива р - действительные размеры предмета.
Если цена деления окулярного микрометра неизвестна, то ее можно определить с помощью объектного микрометра с известной ценой деления (обычно это 0,01 мм). Объектный микрометр помещается на место препарата и в окуляр наблюдаются совмещенные изображения обеих шкал.
3. Метод темного поля. Используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции (конденсором тёмного поля).
Рис. 12 Рис. 13
Конденсор темного поля состоит из нескольких линз особой формы, образующих наклонные пучки света, которые освещают препарат, но затем приходят мимо объектива (рис. 13,б). Ход лучей через конденсор К, предмет П и объектив О при наблюдении в светлом поле показан на рис. 13,а. Аналогичный ход лучей при наблюдении в темном поле - на рис. 13,б. Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.
|
|
|
4. Фазово-контрастный метод.
|
| Рис.14 |
Метод фазового контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов (рис.14), невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе. Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости, которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.
Допустим, что в простейшем случае в однородной среде препарата П (рис. 15), освещенной пучком РР параллельных лучей, имеется точечный объект М, вызывающий дифракцию света. Лучи РР, прошедшие через среду, сходятся в главном фокусе F объектива и затем падают на экран Э расходящимся пучком. Лучи MN, образовавшиеся вследствие дифракции света на объекте М, падают на объектов расходящимся пучком и сходятся на экране в точке М', являющейся изображением объекта М. Между лучами Р и MN имеется некоторая разность хода, которая с помощью оптического устройства, называемого фазовой пластинкой, увеличивается примерно до половины длины волны. Вследствие этого в точке М' прямые лучи РР и дифрагировавшие MN интерферируют и взаимно гасятся. Поэтому изображение объекта М наблюдается затемненным на светлом фоне окружающей среды.
Рис. 15
Фазовая пластинка К представляет собой слой прозрачного вещества определенной толщины с определенным показателем преломления, имеющий форму кружка очень малого диаметра. Пластинка помещается в главном фокусе объектива. Таким образом, через фазовую пластинку проходят только лучи РР, которого и получают при этом дополнительную (по отношению к лучам MN) разность хода.
|
|
|
Для фазово-контрастной микроскопии применяют особые объективы, содержащие фазовую пластинку, и специальные конденсоры. Все эта детали устанавливаются в обычный биологический микроскоп.
5. Поляризационная микроскопия
|
| Рис.16 |
Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов (рис.16), включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани (мышечная ткань и др.). Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.
|
| Рис.17 |
6. Метод интерференционного контраста
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп (рис.17). Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Можно сказать, что метод интерференционного контраста сходен с методом фазового контраста - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью. Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста - это возможность измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии относятся также методы использования микроинтерферометров.
|
|
|
|
| Рис.18 |
7. Метод исследования в свете люминесценции
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов (рис.18), которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен - возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии, иммунологии и паразитологии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.
Рис. 19
8. Капилляроскопия. В клинике применяется метод наблюдения капилляров в коже у живого человека, называемый капилляроскопией. Наблюдение обычно производится в области ногтевой складки пальцев руки, где капилляры расположены горизонтально и относительно поверхностно. Для просветления кожи на нее наносят каплю глицерина. С помощью осветителя О (рис. 19,а) обеспечивается сильное боковое освещение. Свет проникает на некоторую глубину просветленного слоя кожи, и в микроскопе М (в отраженном свете) наблюдаются петли капилляров (рис. 19,б), которые можно сфотографировать.
9. Счет форменных элементов крови. С помощью микроскопа производится счет форменных элементов крови. Для этого применяются специальные счетные камеры. Счетная камера (рис. 20,а) представляет собой тонкую стеклянную пластинку с круглым плоским углублением, на дне которого нанесена измерительная сетка (рис. 20,б). Камера укрепляется на предметном стекле.
а) 
б) 
Рис. 20
В счетную камеру помещают каплю разведенной в 100 раз крови. Камеру закрывают сверху хорошо протертым покровным стеклом и ставят на предметный столик микроскопа. Сосчитывают форменные элементы в нескольких квадратах сетки, находят среднее, умножают его на переходный коэффициент и получают количество тех или иных элементов крови, отнесенное в 1 мм3 ее объема.
|
|
|
