Взятие, пересылка и подготовка материала для вирусологического исследования.

Химический состав вирусов.

Вирусы – это внеклеточные формы жизни, но обладают собственным геномом и способны к размножению, только в живой клетке.

Молекулярная масса вирусов – Дальтон (Д)

Размер вирусов (нм = мкм)

Имеет 2 формы:

-вне клетки – вирион (вирус в покое).

-в клетке

Вирусы деляться на простые и сложные:

Простые вирусы содержат НК + незначительное количество белка.

Сложные вирусы содержат НК + большое количество различных белков и липопротеидную оболочку. Генетические свойства белков обуславливаются их первичной и вторичной структурой.

Вирусы содержат 4 основных класса белков:

- белки капсида

- белки сердцевины

- белок наружной оболочки

- ферментативные белки.

 

Строение куриного эмбриона и методы заражения.

Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день.

Топография куриного эмбриона:

 

1. Скорлупа

2. Подскорлупная оболочка

3. Воздушная камера

4. Аллантоисная полость

5. Желточный мешок

6. Альбуминный мешок

7. ХАО – хорион-аллантоисная оболочка

8. Амниотическая полость

9. Эмбрион

10. Канатик (соединение желточного мешка с пуповиной)

 

Для заражения выбирают здоровые эмбрионы. Для этого проводят овоскопию. На скорлупе делают пометки карандашом – границы воздушной камеры и местоположение зародыша.

 

I. Заражение в аллантоисную полость.

 

Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут:

- название вируса

- дату

- фамилию

 

II. Заражение через искусственную воздушную камеру на ХАО.

1. Делается отверстие в области воздушной камеры.

2. Делается окошко «А»

3. Отсасывается воздух из воздушной камеры.

4. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем.

5. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия.

Индикация вируса в курином эмбрионе.

1. Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные.

2. Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений.

- Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины).

- Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза.

- Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация.

- Органы зародыша – некроз, кровоизлияния.

3. Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур)

Физическая структура вирусов.

Вирусы имеют каждый свою морфологию.

Вирусная частица хорошо приспособлена к переносу НК от одной клетки к другой. Различают:

- вирусные частицы, имеющие липидную оболочку,

- вирусные частицы не имеющие наружной оболочки.

Типы структур:

- палочковидные (спиралевидные)

- нитевидные

- кубической (икосаэдрической) формы.

Суб единица вируса – единая, уложенная определенным образом полипептидная цепь. Капсид – белковый чехол, окружающий ДНК.

Взятие, пересылка и подготовка материала для вирусологического исследования.

1. Не допускать рассеивания вируса в окружающую среду.

2. Не допускать контаменации (загрязнения) вирус содержащего материала бактерия ми и грибами.

3. Личная безопасность.

Летальный исход при вирусном заболевании происходит если:

- заболевание выражено пантропным вирусом, который поражает все виды клеток.

- Если вирус поражает клетки жизненно важных органов.

- Если на фоне вирусного заболевания идет вторичное бактериальное осложнение.

Методы борьбы.

 

1. Профилактика. Специфическая (вакцинирование, серопрепараты)

Не специфическая (соблюдение правил зоогигиены)

2. Лечение – нет

4. Диагностика.

- предварительный диагноз

- окончательный диагноз

 

Предварительный диагноз.

 

1. Клинические симптомы.

2. Патологоанатомические данные.

3. Эпизоотологические данные (виды заболевших животных, % заболевших животных, скорость распространения)

 

Окончательный диагноз.

От больных или погибших животных берется патологический материал, нахождение вируса в котором наиболее вероятно, т.е. материал из пораженных органов а так же кровь, истечения, фекалии и т.д.

 

Правила взятия патологического материала.

1. Материал берется АСЕПТИЧЕСКИ.

2. Количество материала 10-20 грамм (посмертно не позднее 2-3 часов после смерти.

3. Материал берут с учётом его максимальной концентрации и тропизма.

Для сохранения используют охлаждающие смеси.

1. СО2 – сухой лёд (-71 С)

2. Жидкий азот (-196 С)

3. Снег или лёд + NaCl (-18 С)

При транспортировке вирус содержащего материала в целях безопасности необходимо наличие дезинфектантов.

- фенол

- формалин (10%)

При наличии особо опасного материала вирус транспортируют 2 человека.

 

1. Современная классификация вирусов При разработке первых классификаций в основу их были положены различные принципы.1. По виду поражаемых организмов вирусы были разделены на четыре группы— вирусы растений, животных, бактерий и насекомых. 2. По тропизму вирусов к определенным тканям они группировались на нейротропные, пневмотропные, дерматропные и пантропные вирусы. 3. По механизму передачи инфекции их делили на пять основных групп: а) возбудители инфекций с кишечным механизмом передачи – кишечные вирусы; б) возбудители инфекций с воздушно - капельным механизмом передачи – респираторные вирусы; в) возбудителя трансмиссивных инфекций – арбовирусы; г) возбудители инфекций наружных покровов – дерматропные вирусы; д) возбудители инфекций с различными механизмами передачи. Кроме того, существует еще клинико-этиологическая группировка вирусных заболеваний. В соответствии с этим принципом различают следующие вирусные заболевания: а) респираторные инфекции; б) энтеровирусные инфекции; в) заболевания, вызванные дермо- и нейротропными вирусами; г) заболевания, вызванные висцеротропными вирусами.

В основу одной из первых современных классификаций (Львов с соавторами, 1962) положены следующие критерии: 1) тип нуклеиновой кислоты; 2) тип симметрии; 3) диаметр капсиды или число капсомеров; 4) наличие внешней оболочки.

В соответствии с этими критериями вирусы по типу нуклеиновой кислоты распределили па две группы: на ДНК-вирусы и РНК-вирусы, а по типу симметрии капсиды – на спиральные, икосаэдрические и комплексные. По наличию или отсутствию внешней оболочки различают вирусы оболочечные и нуклеокапсидные (безоболочечные). При классификации вирусов учитывали следующие структурно-химические свойства их: 1) тип нуклеиновой кислоты; 2) размер вируса; 3) диаметр капсиды или число капсомеров; 4) место репродукции вируса – в ядре или цитоплазме; 5) наличие внешней оболочки; 6) место формирования-вириона – на поверхности клетки или в цитоплазме; 7) чувствительность к эфиру.На основе этих критериев на VIII Международном конгрессе микробиологов (1962) вирусы позвоночных было рекомендовано распределить на следующие восемь групп: Poxviruses, Herpesviruses, Adenoviruses, Myxoviruses, Arboviruses,. Picornaviruses, Reoviruses, Papovaviruses.В конце 1970 года Международный комитет по номенклатуре вирусов предложил все вирусы разбить на 42 группы (рода), из которых 18 родов составляют вирусы позвоночных. Новый этап в таксономии вирусов характеризуется формированием болеекрупных таксономических групп — семейств, родов.

Правила номенклатуры вирусов дают определение виду, роду и семейству. Вид вируса — класс вирусов, характеризующийся большим числом критериев, образующий реплицирующуюся линию и занимающий особую экологическую нишу. Род — группа видов с определёнными общими характеристиками, отличающимися от вирусов других родов. Критерии для выделения родов включают: феномены генетических взаимодействий, круг восприимчивых хозяев, патогенность, географическое распространение, способ передачи, антигенные свойства. Семейство — группа родов с общими характеристиками, отличающимися от вирусов других семейств. Критерии, используемые для деления на семейства, включают фундаментальные свойства вирионов: тип и структуру нуклеиновойкислоты, наличие липопротеиновой оболочки, стратегию вирусного генома, размер и морфологию вирионов.

58. Особенности работы вирусологической лаборатории и её оборудование. Вирусологическая лаборатория используется для проведения лабораторных диагностических исследований на вирусные инфек­ции, контроля состояния и напряженности специфического постинфекционного и поствакцинального про­тивовирусного иммунитета, и участия в профилактических мероприятий с вирусными заболева­ниями.

Как правило, вирусологические лаборатории, независимо от специализации, должны размещаться в чистых светлых помеще­ниях с необходимым оборудованием и мебелью.). Независимо от характера выполняемой работы в них необходимо поддерживать рабочую чистоту. Кроме еже­дневной обычной уборки, помещения периодически обрабатывают растворами дезинфицирующих веществ (карболовой кислоты, ли­зола, хлорной извести, хлорамина и т.п.) и подвергают ультра­фиолетовому облучению. Комнаты, предназначенные для работы с вирусами, должны быть хорошо освещены и состоять из двух от­делений, разобщенных стеклянной перегородкой: предбоксника и бокса. В предбокснике должны быть стерильные халаты, тапоч­ки, маски, которые надевают перед работой, а так же можно размещать дополнительное оборудование.: термостаты, холодильники, центрифуги лабораторные, микроскопы, водяную баню и пр.

В боксе, кроме рабочих столов и стульев, должно быть все необходимое для работы: стерилизаторы для инструментов, банки с дезрастворами для отработанных пипеток, бак с дезраствором для сбора отработанных материалов, баночки со спиртом, йодом, штативы для пробирок, пробирки с бульоном для проверки бактериального загрязнения, стерильные пипетки, ступки и т.д.

Регистрация поступающего на исследование патологи­ческого материала проводят в приемной. В комнате для предварительной обработки материала прово­дят вскрытие трупов и отбор материала для дальнейшего иссле­дованияКомнату для вирусологических исследований оборудуют: термостатами, холодильниками, центрифугами, весами различных типов, электроплитками, фильтрами, насосами, водяными банями, электромагнитными мешалками и т д.. На столах для определенных операций за каждым работаю­щим закрепляют рабочее место. Здесь размещают нужную аппа­ратуру, соответствующие дезинфицирующие средства, краски, реактивы. На операционном столе необходимы микроскоп, набор инструментов (пинцеты, ножницы, скальпели и др.), вата, пасте­ровские пипетки, стерильные и обезжиренные покровные и пред­метные стекла, физраствор. При работе с куриными эмбрионами должны быть подставки для яиц, овоскопы, инструменты для вскрытия (ножницы, глазные пинцеты).

В автоклавной необхо­димо иметь два автоклава, для чистых материалов – где стерилизуют посуду, питательные среды, инструменты, обезвреживают заразный материал - и для инфици­рованных, бак для сбора инфицированного материала. Допускается наличие сушильных шкафов, дистилляторов, столов и шкафов для стерильной посуды.

Моечная предназначена для мытья посуды и приборов. Виварием называется помещение, используемое для выращивания и содержания лабораторных животных. Лабораторных животных содержат в клеткахСотрудники вирусологической лаборатории обязаны соблю­дать правила, предупреждающие попадание бактерий и плесневых грибов в исследуемый материал и возможность внутрилабораторных заражений персонале и распространения инфек­ции. В лабораторий установлен единый порядок обращения с вирусами, предусматривающий правила их хранения, регистрации, передачи от одного сотрудника другому внутри лаборатории и за ее пределы.

64. Сплит-вакцины, методы получения. Вакцины из расщеплённого вириона (сплит) после обработки эфира содержат осколки разрушенных вирусных частиц (АГ + баластные примеси).При обработке вирионов этиловым эфиром удаляются липиды.

3 метода получения:

1. получаем большое количество вирусов, их выделяют и получают, имунногенные субъединицы – сплит-вакцины (дорогой способ).

2. Химический синтез специфического иммуногена, но для этого над знать структуру и амминокислотный состав Аг. После их синтеза их соединяют белком носителем. Затем эту смесь используют в качестве вакцины.

3. Генная инженерия. Установлена у отдельных вирусов. Мозаичность генов, т.е. гены кодируются определённый белок имеют вставки, которые не имеют отношения к синтезу белка. Чтобы ген-инфекция реализовалась, вставки вырезают специальными ферментами. Генноинженерные вакцины получают с помощью биотехнологий.

 

57.Условия транспортировки и хранения вируссодержащего материала в лаборатории. Взятые пробы необходимо как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов инактивации вируса. Такие условия обеспечивают низкие темпе­ратуры. Для этого пробирки (флакончики) с патматериалом, закрытые резиновыми пробками, помещают в термос с охлаждаю­щей смесью.

Структура упаковочного контейнера:

Первичная емкость: емкость, содержащая пробу (пробирка с завинчивающейся проб­кой с нетоксичной резиновой прокладкой, обернутой лейкопластырем, или запаянная стеклянная ампула);

Внутренняя упаковка: - поглощающий материал — папиросная бумага или вата в количестве, достаточном для впитывания жидкости в случае утечки;

- пластиковый мешок, заполненный или заклеенный неволок­нистым лейкопластырем;

Наружная упаковка: -противоударная прокладка, (скомканная бумага или вата);- твердый водо­непроницаемый контейнер;- плотно пригнанная крышка, завинчиваемая или уплотняемая, заклеиваемая лейкопластырем или закрепляемая зажимами.

В качестве охлаж­дающей смеси используют смесь равных частей сухого льда (твер­дая углекислота) и этилового спирта, тогда температура минус 71 °С держится несколько дней. Можно использовать смесь, состоящую из трех весовых частей льда или снега и одной весовой части по­варенной соли. В последнем случае удается получить температуру минус 15... 20 °С. Вместо замораживания можно использовать хими­ческие консерванты, но это менее эффективно. Лучшим из них считается смесь равных объемов стерильного глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор). Обычно эту смесь рекомендуют использовать для консервирования кусоч­ков паренхиматозных органов и тканей.

Глицерин — это простейший трехатомный спирт. Он сме­шивается с большинством компонентов живой клетки. В него бы­стро диффундирует вода и электролиты, а сам он легко проникает в другие растворы и гели и не переходит в твердое состояние при низких температурах - минус 110 °С.

Патматериал снабжают надежной и четкой этикеткой, недопустимо делать надписи карандашом по стек­лу. На пробирке или флакон­чике достаточно надежной является этикетка из лейко­пластыря, которую подписы­вают простым карандашом. На термос с пробами патма­териала навешивают бирку из картона или фанеры, на ко­торою указывают хозяйство, вид животного, вид материала и дату. Термос опечатывают. Взятый материал с сопроводитель­ным документом, содержащим полную информацию о животном, от которого взяты пробы, об эпизоотологических данных хозяйст­ва, предположительном диагнозе мерах, принятых для ликви­дации болезни (лечение, вакцинации и т.д.), а также дату и фа­милию ветеринарного врача. Этими данными руководствуются при выборе направления лабораторных исследований. Доставленные в лаборатории пробы рекомендуется немедленно использовать для выделения вируса. Если по каким-то причинам (отсутствие экспериментальных животных, куриных эмбрионов, культур клеток) исследование откладывается, матери­ал хранят при температуре минус (40... 70) °С.

12Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: