 |
Окраска генциановым или метиловым фиолетовым
|
|
|
|
Для ориентировочной окраски бактерий можно воспользоваться также карболовым генциановым фиолетовым или кристаллическим фиолетовым. Однако эти красители при дифференцировке 700 спиртом легче извлекаются из клеточных элементов и бактерий, чем фуксин, поэтому, пользуясь ими, рекомендуется сильно перекрашивать.
Смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового (генцианвиолет) со 100 мл 2,5 % раствора фенола (смесь хранится долго). Мазки окрашивают в течение 2 — 5 мин через фильтровальную бумагу, промывают в проточной воде, сушат и исследуют при масляной иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в густо-фиолетовый цвет.
Окраска карболовым тионином Николя
Смешивают 1 часть насыщенного спиртового раствора тионина с 10 частями 1 % водного раствора фенола, мазки окрашивают 3 - 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 30 секунд в 96 % спирте, снова ополаскивают в воде и высушивают. Препарат изучают при масляной иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в темно-синий цвет.
Окраска акридиновым оранжевым по Дарту-Тернеру
1. Мазки фиксируют в смеси равных частей диэтилового эфира и 95 % этилового спирта в течение 1ч.
2. Проводят через спирты нисходящей концентрации (80 %, 70 %, 50 %) и дистиллированную воду, окуная мазок по 5 раз в каждую порцию.
3. Окунают 4 раза в 1 % уксусную кислоту.
4. Переносят в дистиллированную воду на 2 мин.
5. Помещают на 3 мин в ацетатный буфер (рН 3,8).
6. Переносят в 0,01 % забуференный раствор акридинового оранжевого на 3 мин.
7. Дифференцируют 4 мин в ацетатном буфере (рН 3,8).
8. Протирают концы предметных стекол, а затем осторожно удаляют избыток буферного раствора фильтровальной бумагой.
|
|
|
9. Заключают под покровное стекло в буферный раствор и оставляют на 2 мин. Препарат исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа сразу либо, если мазок оставляют надолго, держат в темноте и парафинируют края покровного стекла. Флюоресценция сохраняется в течение 3 мес.
Результат: бактерии, дрожжи, грибы рода Candida окрашиваются в красный цвет, паразиты — в красный с желтыми ядрами; лейкоциты — ярко-зеленые.
Окраска по Граму
Красящие растворы.
Раствор кристаллического фиолетового по Эрлиху: 1,2 г кристаллического фиолетового растворяют в 12 мл 96 % спирта и добавляют 100 мл свежеприготовленной анилиновой воды, полученной при смешивании 2 мл анилина со 100 мл воды. Эта красящая смесь может храниться 2 нед. Вместо кристаллического фиолетового можно использовать метиловый фиолетовый.
Красящие смеси для грамположительных бактерий:
1) 10 г кристаллического фиолетового + 100 мл спирта;
2) 10 г генцианового фиолетового +100 мл спирта;
3) 10 г метилового фиолетового + 100 мл спирта;
4) 1 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового + 10 мл дистиллированной воды;
5) 0,25 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового +100 мл 5 % раствора уксусной кислоты;
6) 8 - 9 г метиленового синего +100 мл спирта;
7) 30 мл насыщенного раствора метиленового синего в спирте + 1 г гидроксида калия + 99 мл дистиллированной воды.
Красящие смеси для грамотрицательных бактерий:
1) 8 — 9 г основного фуксина + 100 мл 96 % спирта;
2) 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина + 10 мл дистиллированной воды;
3) 1 г основного фуксина +1 г фенола + 0,5 мл глицерина + 10 мл 96 % спирта +100 мл дистиллированной воды;
4) 0,2 — 0,5 % водный раствор сафранина либо 0,25 % раствор сафранина в 10 % спирте.
Методика окраски.
1. Мазки крови, цереброспинальной жидкости, экссудатов фиксируют над пламенем горелки (быстро проводят 3 раза над пламенем, так чтобы мазок прогревался до 70-800С в течение 3-4 с), затем высушивают. Кроме фиксации над огнем, для мазков применима фиксация в метиловом спирте (5 мин) или в парах формалина (в сосуде Коплина) в течение 15 мин.
|
|
|
2. Наливают на фиксированный мазок карболовый или анилиновый генциановый фиолетовый (или кристаллический фиолетовый) на 2—3 минуты. Во избежании осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. Очень удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно пропитанной 1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и затем высушенной. Такую окрашенную и высушенную бумагу накладывают на мазок и смачивают дистиллированной водой. Продолжительность окрашивания остается прежней (2—3 мин.).
3. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу и быстро споласкивают в водопроводной воде (15—30 секунд).
4. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя иди другим йодистым раствором, например по Граму (2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода, доливают до 300 мл, а по Вейгерту до 100 мл дистиллированной воды).
5. Раствор сливают, мазок промывают водой (водопроводной или дистилированной).
6. Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-40-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают.
Если вместо спирта использовать ацетон, то промывание продолжается 30 с. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.
7. Промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1 — 2 мин.
8. Дополнительно окрашивают (для выявления грамотрицательной группы бактерий) либо 0,5% водным раствором нейтрального красного (нейтральрот), либо разведенным (в 10 раз) карболфуксином Циля — 1-2-3 минуты. Возможна докраска сафранином (0,2-0,5 % водный раствор или 0,25 % раствор в 10 % спирте) основным коричневым (бисмаркбраун) либо пиронином J или В (2-5 мин).
9. Промывают в проточной воде 5 с и высушивают фильтровальной бумагой.
Результат: Грамположительные бактерии окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, грамотрицательные - в красный или коричневый в зависимости от красителя; ядра клеток — ярко-красные, цитоплазма — розовая.
|
|
|
Следует заметить, что в классической прописи при окраске по Граму обычно не промывают мазки в воде ни после окраски генциановым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни после обработки раствором Люголя, ограничиваются лишь сливанием растворов. Предлагаемое промывание в воде имеет целью только чистоту в работе, тем более, что оно ни в какой мере не отражается на результатах окрашивания.
Окраска по Романовскому-Гимзе
Приготовление красителя
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.
Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.
Методика окраски
1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 — 6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного плазмодия — 7,0 — 7,2.
2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный.
|
|
|
