 |
Технология конструирования и работы с рекомбинантными ДНК
|
|
|
|
Л Е К Ц И Я №10
Основы генетической инженерии.
В первой половине 70-х годов ХХ в. развитие молекулярной биологии привело к возникновению новой экспериментальной технологии, которая получила в СССР название “генная инженерия”, а в западной литературе именуется “работой с рекомбинантными молекулами ДНК”.
Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой два компонента, соединенные в бесклеточной системе: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной ») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы, которые нужно перенести в реципиентную клетку (клетка-хозяин). Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, биохимии нуклеиновых кислот и др. Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П.Бергом с сотр.) и была составлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бактериофага λdvgal с галактозным опероном Е. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.
Технология конструирования и работы с рекомбинантными ДНК
Сущность генетической инженерии сводится к целенаправленному конструированию искусственных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. К числу таких свойств можно отнести синтез аминокислот и белков, гормонов, ферментов, витаминов и др. Источником генетического материала могут выступать различные организмы не способные в обычных, природных условия, к обмену генетической информацией с организмами - реципиентами.
|
|
|
В настоящее время не существует единого, универсального набора методик, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме.
1.Из организма - донора нужных генов - экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее избирательному ферментативному гидролизу по определенным участкам (расщепляют, разрезают) с помощью соответствующих рестриктаз и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК»).
2. Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется т рансформацией.
3.Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).
4.Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.
Рассмотрим эти процессы поподробнее.
Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми бактериальными внутриклеточными ферментами - рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК.
Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме продуцирующих их бактерий замаскированы метилированием остатков дезоксирибозы 
с помощью ферментов-метилаз.
Согласно номенклатуре, предложенной X. Смитом и Д. Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает родовое название, две последующие - первые буквы вида.
|
|
|
Например, фермент из Е. coli обозначают как Есо или из Haemophilus influenzae - Hin и т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRI или Hindll и т. д. В настоящее время различные фирмы выпускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молекулыДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными (или рестриктами) с тупыми либо липкими концами).
Если рестриктазы вносят разрывы вдве цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов то на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки, способные образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (“липкие концы”). Если разрыв происходит без смещения, то образуются фрагменты ДНК c “тупыми концами”.
Один из важнейших этапов конструирования молекулы рекомбинантной ДНК является лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК-лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, может проходить как по “липким”, так и по “тупым” концам. Однако эффективность сшивки по “тупым” концам ниже чем по “липким”.
-- -- АТГЦААТТ ЦАГТЦ-- -- -- --ГЦГГ ЦЦГТ-- --
-- -- ТАЦГ ТТААГТЦАГ-- -- -- --ЦГЦЦ ГГЦА-- --
 | |||
 | |||
|
|
|
