сшивание с помощью линкера

Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем часто в середину линкера помещают какой либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее можно ввести в жи­вые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведе­нию, ее быстро разрушат внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического ап­парата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном (в хромосому) и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные ак­цептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обла­дать следующими особенностями:

1. Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции, в которые после их разрезания можно встроить нужный ген.

2. Иметь свойства репликона, т.е самовоспроизводиться.

3. Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникно-вения вектора в клетку придают ей фенотип, сви­детельствующий о присутствии вектора.

В частности, для бактериальных векторов в качестве маркерных генов чаще всего используются гены, вызывающие устойчивость клеток к некоторым антибиотикам.

4. Иметь малый размер и способность проникать через клеточную оболочку

Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроен­ных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д.

Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов исполь­зуют плазмиды. Плазмидами называют специфические бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), способные к длительному автономному существованию и стабильно насле­дуемые. Они представляют собой двуцепочечные кольцевые моле­кулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. По разме­ру они соответствуют 1 - 3 % от хромосомы бактериальной клетки. Так, молекулярная масса одной из самых мелких плазмид, найденных у Е. coli, составляет 1,5 МДа, а клетки псевдомонад содержат плаз­миды с Мг около 300 МДа, что составляет 15 % от Mв хромосом этих бактерий. Плазмиды разделяют на конъюгативные, способ­ные сами перенестись в реципиентные клетки с помощью конъю­гации, и неконъюгативные, не обладающие этим свойством. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды)и др. Например, плаз­миды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. coli. Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis. F-плазмида Е. coli или FP-плазмиды псевдомонад являются поло­выми факторами. Плазмида pSIOl с Мг 5,8 МДа несет ген устой­чивости к тетрациклину (селективный маркер). У различных мик­роорганизмов - Е. coli, Salmonella, Bacillus, Saccharomyces обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез разных колицинов - высокоспецифических антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов микроорганизмов того же вида или родственных видов. Количество плазмид в клетке может коле­баться от одной до более ста. В целом, чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке.

Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. coli R_6-5 с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур.

Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида (ColE1), от­носящаяся к группе колициногенных плазмид Е.coli. ColE1 реп­лицируется независимо от хромосомы и присутствует в количе­стве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благо­даря селективному маркеру (способность к синтезу антибиотика колицина) в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. coli.

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное при­менение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы - дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Клонируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, напри­мер бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве век­торов применяют сконструированные производные фага λ и фа­гов М13 и fd. В векторах на основебактериофага λ используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке и может быть удалена. Это позволяет вводить вместо нее чужеродную, клонируемую ДНК в ДНК фага λ и использовать его в качестве вектора.

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чу­жеродными генами часто называют гибридными (или химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинант­ных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предвари-тельную обра­ботку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток (раствор СаС1₂) за счет увеличения проницаемости клеточной стенки, с последующим их помещением в селективирующую среду, в которой способны существовать только клетки, получившие век­торную молекулу, например в среду с определенным антибио­тиком. Другим способом увеличения проницаемости клеточной стенки является электропорация, когда клеточную суспензию обрабатывают короткими импульсами переменного тока высокого напряжения (порядка 2500 вольт). После такой обработки эффективность трансформации повышается, в зависимости от размеров плазмид, в 10⁶ – 10⁹ раз.

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэто­му среди бактерий, подвергшихся трансформации, только неболь­шая часть оказывается трансформированной (обычно одна из тысячи). Кроме того, часть этих бактерий может содержать исходную, не трансформированную плазмиду. Отделение клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, от об­щей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клони­рования трансформиро-ванную бактериальную суспензию низкой концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар или чаще на нитроцеллюлозные фильтры, помещенные на чаш­ку Петри с питательной средой, из расчета 5 - 10 бакте­рий на 1 см² поверхности. Бактериальная клетка на поверхности фильтра начинает делиться с образованием в итоге маленькой коло­нии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки кото­рого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя рассмотренную ранее плазмиду pBR322, содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бак­терий в питательную среду добавляют антибиотик - или ампициллин, или тет­рациклин в зависимости от того, какой из генов (blа или tet) ос­тался интактным (неповрежденным) после введения чужеродной ДНК. На такой сре­де клоны образуют клетки только с плазмидами (рекомбинантными и нерекомбинантными), а все остальные погибают. Для отделения рекомбинантных бактерий от исходных используют следующую технологию. К фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцеллюлозный фильтр (фильтр-реплика), который затем переносят на чашку Петри с аналогичной питательной средой, но, содержащей антибиотик, ген ус­тойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих фильтрах дают клоны только те бактерии, кото­рые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Анализируя расположение клонов на исходном фильтре, и фильтре-реплике, выделяют колонии, содержащие трансформированные клетки.

При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод радиоавтографии, основанный на способности двух любых одноцепочечных комплиментарных фрагментов ДНК спариваться (гибридизоваться) между собой. Если один фрагмент (ДНК-зонд, гибридизационный зонд) содержит радиоактивную метку (обычно изотоп фосфора 32 или иода 125), то радиоактивной будет и гибридизованная молекула ДНК или ее фрагмент.

Технология подготовительного этапа радиоавтографического скрининга имеет много общего с описанной выше процедурой, используемой при клонировании. Полученную с трансформированной бактериальной колонии фильтр-реплику подвергают щелочной обработке при высокой температуре. При этом клетки в колониях лизируются, а клеточная ДНК денатурируется с разрушением двойной спирали и одиночные цепи связываются с нитроцеллюлозой в том участке, где была расположена соответствующая колония. Далее фильтр подвергают обработке раствором, содержащим специально приготовленные, меченные изотопами, одноцепочечные фрагменты клонируемой ДНК а затем промывают для удаления раствора с ДНК-зондом. На тех участках фильтра, где находились трансформированные клетки будет происходить процесс гибридизации клонируемой ДНК с ДНК-зондом и они окажутся радиоактивными.

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Технически эта процедура имеет много общего с гибридизацией. Все кле­точные линии (клоны) высевают на чашки с питательной средой. Выросшие коло­нии переносят на фильтр, клетки лизируют, а высвободившиеся белки фиксируют на фильтре. Затем на фильтр наносят первые антитела, кото­рые специфически связываются с данным бел­ком (антигеном), все несвязавшиеся антитела удаляют, а фильтр помещают в раствор вторых антител, специфичных в отношении первых ан­тител. Во многих тест-системах используют конъюгаты вторых антител с ферментом, напри­мер с щелочной фосфатазой. После отмывания фильтра добавляют бесцветный субстрат. Если вторые антитела связываются с первыми, то под действием фермента происходит гидролиз суб­страта с образованием окрашенного вещества в том месте, где идет реакция. Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протя­женный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми анти­телами. По окончании иммунологического скрининга необходимо дополнительно определить, какой именно из отобранных кло­нов содержит полноразмерный ген.