Интеграция чужеродной ДНК в хромосому хозяина

Лекция №11

Оптимизация экспрессии клонированных генов.

Успешное осуществление процедуры клонирования чужеродного гена в нужном организме - хозяине еще не означает, что этот ген обязательно будет эффективно экспрессирован. Это обусловлено тем, что, обычно, кодируемый этим геном белок не только не нужен клетке, но и дополнительно требует для своего синтеза энергию (АТФ) и различные метаболиты (аминокислоты, азотистые основания, моносахариды и т.д.), что замедляет или даже нарушает процессы нормального клеточного метаболизма. В то же время, чтобы получение целевого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким.

Поэтому подбор оптимальных условий для эффективной экспрессии (транскрипции и трансляции) клонируемого гена является одной из ключевых операций генетической инженерии.

Никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонирован-ных генов не существует. Большинство таких генов имеют уникальные молеку-лярные свойства, и оптимальные системы экспрессии для каждого из них приходится подбирать индивидуально. Эффективность экспрессии любого чужеродного гена существенно зависит от степени родства организма донора ДНК с организмом хозяином. Несмотря на то, что многие представители как про-, так и эукариотических организмов способны к экспрессии чужеродных генов, для получения важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК ис­пользуют в основном Escherichia coli. Это связа­но, прежде всего, с тем, что сейчас достаточно хорошо изучены многие генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганиз­ма. Кроме того, он достаточно хорошо культивируется в обычных условиях на дешевых и простых питательных средах и является безопасным в обращении. Помимо Escherichia coli для экспрессии некоторых клониро­ванных генов используются и другие организ­мы-хозяева: В. subtilis, дрожжи, животные, рас­тения и т. д., хотя стратегии, разработанные для Е. соli -систем, в принципе применимы и в этих случаях.

 

 

Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов

Для эффективной экспрессии любого гена со­вершенно необходимо наличие сильного промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе, поэтому прилега­ющие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) транскрибируются. Поэтому на первый взгляд может показаться, что наиболее подходящим условием для экспрессии клонированного гена является встраивание его в плазмиду так, чтобы он находился под контролем такого постоянно функционирующего сильного про­мотора. Однако непрерывная экспрессия чуже­родного гена может оказаться гибельной для клетки-хозяина, поскольку приводит к истоще­нию ее энергетических ресурсов и нарушению метаболизма. Такие клетки будут очень медленно размножаться или вообще не будут делиться. Кроме того, плазмиды, несущие постоянно (конститутивно) экспрессирующийся чужеродный ген, нередко утрачиваются после нескольких клеточных циклов, поскольку не содержащие их клетки (или клетки содержащие меньшее их количество) растут быстрее и со временем становятся в культуре преобладающими. Нестабильность плазмид (утрата плазмид) - это основная проблема, мешающая получению продукта, локализованного в генах плазмид, в значительных количествах. Для ее решения нужно научиться контролировать экс­прессию и управлять ей таким образом, чтобы клонированный ген экспрессировался только в определенной фазе роста клеточной культуры (конец log –фазы, const –фаза) и только в течение опре­деленного времени, а для этого нужно использо­вать не просто сильные, а сильные регулируемые промоторы. Плазмиды, сконструированные для этих целей, называются экспрессирующими векторами.

 

Регулируемые промоторы

Наиболее широко для создания экспрессирующих векторов используются следующие сильные регулируемые промоторы: промоторы lac - и trp-оперонов Е. coli; специально сконстру­ированный tac - промотор, состоящий из отдельных фрагментов lac - и trp-оперонов и ряд других. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, ко­торые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.

В отсутствии лактозы в среде lac - промотор Е. coli находится в репрессированном состоянии и транскрипция его гена блокирована. Индукция, или включение lac - оперона происходит при добавлении в среду лактозы. Аналогично, активность trp-оперна регулируется добавлением триптофана.

Другим способом регулирования экспрессии является использование термочувствительных промоторов, например промотор бактериофага рL. Белок- репрессор, блокирующий данный промотор, активен при 31⁰С, но неактивен при 38⁰С, следовательно, при инкубировании бактерий при 31⁰С клонированный ген не экспрессируется и, наоборот повышение температуры вызывает инактивацию репрессора и высокий уровень синтеза нужного белка. Это очень удобно, т.к. позволяет управлять процессом культивирования продуцента, проводя его наработку при 31⁰С и вызывая синтез целевого продукта только при достижении оптимального состояния культуры (стадия роста, плотность), путем повышения температуры до 38⁰С.

Наличие регулируемых промоторов позволяет предотвращать преждевременный, бесконтрольный синтез неконститутивных рекомбинантных белков, который будет тормозить рост клеточной культуры в lag- и log-фазах и запускать его только после накопления необходимого, оптимального количества биомассы клеток (в стационарной фазе).

Суммарная активность экспрессируемого гена возрастает с ро­стом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Ис­пользуя многокопийные плазмиды, можно обеспечить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Поэтому получение бактериаль­ных штаммов-сверхпродуцентов - одна из важ­нейших задач современной биотехнологии в экономическом, ме­дицинском и социальном аспектах. Обычно используемые сейчас плазмидные векторы поддержива­ются в клетке в количестве 20-50 копий и это не предел. Так в лабораторных условиях получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до 1- 2 тыс. ко­пий на клетку без нарушения жизненно важных функций бакте­рий. Естественно, подбор условий культивирования для таких продуцентов играет решающее значение.

Интеграция чужеродной ДНК в хромосому хозяина

Наряду с достоинствами использование рекомбинантных плазмиид имеет целый ряд существенных недостатков, связанных с возможностью их утраты клетками в процессе длительного культивирования.

Это обусловлено тем, что при наличии в клетке чужеродной химерной плазмиды часть энергети­ческих и материальных (аминокислоты, нуклеотиды) ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез чужеродных белков, которые она ко­дирует. Чем больше количество таких плазмид в клетке, тем больше клеточных ресурсов уходит на обеспечение процессов не нужных для ее нормальной жизнедеятельности. Поэтому в процессе роста популяции, клетки содержащие меньшее количество плазмид или потерявшие их совсем растут и размножаются бы­стрее тех, в которых они сохранились на прежнем уровне, и, в конеч­ном счете, оказываются в культуре преобладаю­щими.

В результате по прошествии нескольких генераций количество синтезируемого продукта клонированного гена может значительно уменьшится или он вообще перестанет вырабатываться. Разработано, по крайней мере, два подхода к решению этой про­блемы. В лабораторных условиях для сохране­ния рекомбинантных плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечиваю­щих рост только тех клеток, в которых есть такие плазмиды. Однако добавление антибиотиков и каких-то других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные фер­ментеры приводит к значительному удорожа­нию конечного продукта.

Особенно важно, что­бы клонированные гены сохранялись, не передаваясь другим микроор­ганизмам за счет коньюгации плазмид, в том случае, когда сконструирован­ный микроорганизм предназначен для исполь­зования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть эко­логически безопасным.

Методом, позволяюшим избежать утраты или нежелательной коньюгации клонируемого гена является включение клониро­ванной ДНК непосредственно в хромосомную ДНК хозяйского организма.

При встраивании нужного гена в хромосом­ную ДНК хозяина нужно позаботиться о том, чтобы сайт интеграции не находился внутри ге­на, кодирующего важную клеточную функцию. Для этого чужеродный ген включают в заведомо несущественный участок. Кроме того, для обеспе­чения эффективной экспрессии его помещают под контроль регулируемого промотора. Для ин­теграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать нуклеотидную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с та­ковой в хромосомной ДНК, в пределах которых и должен произойти физический обмен (реком­бинация) между двумя молекулами ДНК.

 

 

Химерные белки

 

Очень часто, даже после успешного клонирования и подбора эффективных условий для экспрессии, чужеродные белки, особенно не­большие, обнаруживаются в клетках лишь в минимальных коли­чествах. Такой кажущийся низкий уровень экс­прессии кодирующих их генов во многих случа­ях объясняется быстрой деградацией этих чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присое­динении продукта клонированного гена к како­му-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клониро­ванного гена оказывается защищенным от рас­щепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов.

Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соот­ветствующих генов.

Другим способом стабилизации белков является включение, генно-инженерными методами, в целевые белки нескольких дополнительных аминокислот в определенной последовательности (маркерные пептиды), которые обычно присоединяют к N-концу полипептидной цепи. Однако этот способ не всегда эффективен.

Перспективным является так же использование мутантных штаммов с искусственно вызванным дефицитом протеолитических ферментов.

И, наконец эффективным способом сохранения клонированных белков является стимулирование их эффективной секреции из клетки.

 

12Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: