 |
Метаболитическая перегрузка
|
|
|
|
Как мы уже отмечали введение в клетку чужеродной ДНК, и ее экспрессия часто приводят к различным нарушениям клеточного метаболизма. Это явление носит название метаболитическая перегрузка и может возникать по разным причинам:
1.Увеличение затрат энергии (АТФ) и метаболитов на экспрессию, как клонированного гена так и генов самого вектора, и возможность их истощения.
2. Нехватка кислорода и невозможность обеспечения им всех метаболити-ческих реакций, как нужных для клетки, так и для экспрессии клонируемого гена.
3. Нарушение внутриклеточной локализации и экспорта жизненно важных клеточных белков, вследствие перепроизводства чужеродного белка
Это может привести к таким нежелательным явлениям как снижение скорости роста трансформированных клеток, потере ими рекомбинантных плазмид или удалению рекомбинантного гена из плазмиды.
Поскольку клеткам, растущим в условиях метаболической перегрузки, не хватает энергии для нормального функционирования, нарушения затрагивают прежде всего такие энергоемкие метаболические процессы, как фиксация азота или синтез белков. Могут изменяться также размер и форма клеток, образовываться слишком много внеклеточного полисахарида, склеивающего клетки друг с другом и затрудняющего микрофильтрацию.
Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного количества чужеродного белка и нехваткой питательных веществ или «строительных блоков» - аминокислот, может произойти запуск стрессовых механизмов, в частности инициироваться синтез клеточных протеаз, под действием которых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка.
Многократно возрастает вероятность трансляционных ошибок. Так для Е. Coli в нормальных условияхонасоставляет 2•10-4 - 2•10-3 % на 1 клетку за генерацию. Однако в условиях нехватки определенных аминоацил-тРНК или гуанизинтрифосфата, что часто случается при суперпродукции чужеродных белков, вероятность включения в белковую молекулу неправильной амино-кислоты, вместо недостающей сильно увеличивается (в десятки и сотни раз).
|
|
|
Это не позволяет использовать синтезируемый белок в качестве лекарствен-ного средства, поскольку:
1) удельная активность и стабильность белка могут быть гораздо ниже ожидаемых;
2) наличие в молекуле «неправильных» аминокислот может вызвать нежелательную иммунологическую реакцию при введении такого белка в организм человека.
Для снижения влияния метаболитической перегрузки используют следующие подходы или их комбинацию:
1.Использование малокопийных плазмидных векторов.
2.Отказ от использования векторов и встраивание клонируемого вектора в хромосомную ДНК организма-хозяина.
3. Использование регулируемых промоторов.
4. На практике эффективным способом увеличения количества чужеродного белка, синтезируемого рекомбинантным микроорганизмом, состоит в поддержании уровня экспрессии его гена на среднем уровне (так, чтобы на долю продукта приходилось примерно 5% суммарного клеточного белка), но при максимальной плотности клеточной культуры, что достигается подбором соответствующих условий (аэрирование, перемешивание, термостатирование). Так микробиологическая система с 5%-ным уровнем экспрессии чужеродного белка и низкой метаболической нагрузкой, в которой плотность может достигать 40 г/л (масса сухого вещества), оказывается более эффективной, чем система с 15%-ым уровнем экспрессии и плотностью 10 г/л.
Направленный мутагенез
Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в природе, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белковые продукты. Однако физические и химические свойства таких «природных» белков часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их промышленного применения. Иногда для получения белков, обладающих нужными свойствами, в качестве источника соответствующих генов используют организмы, растущие в необычных, зачастую экстремальных условиях. Например, для синтеза ά -амилазы, не утрачивающей своей активности при высокой температуре, выделили ее ген из Bacillus stearothermophilus- бактерии, естественной средой обитания которой являются горячие источники с температурой воды 90 °С. Полученная таким образом α -амилаза оставалась активной при более высоких температурах, чем те при которых обычно осуществляют промышленное производство этилового спирта из крахмала. Это значительно облегчает поддержание асептических условий и ускоряет процесс.
|
|
|
Для получения белков с заранее заданными свойствами можно использовать также мутантные формы генов. Однако число мутантных белков, образующихся в результате замены отдельных нуклеотидов в структурном гене с помощью обычного, классического мутагенеза, чрезвычайно велико. Однако даже мутагенез с последующим отбором редко приводит к существенному улучшению свойств исходного белка, поскольку большинство аминокислотных замен (мутаций) сопровождается снижением активности фермента.
Для создания белков со специфическими свойствами можно использовать другой подход, основанный на целенаправленном внесении изменений в кодирующие их клонированные гены (направленный мутагенез). Это позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов, свойствами.
1. С более высокой каталитической активностью
2. Более высокой специфичностью
3. С более высокой стабильностью (температура, диапазон рН)
4. Способные функционировать в безводных растворителях
5. Обладающие и сохраняющие каталитическую активность без участия кофакторов
6. Обладающие повышенной устойчивостью к клеточным протеазам
|
|
|
