Реакции с применением меченых компонентов. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и радиоиммунный анализ (РИА). Механизм, способы постановки, компоненты реакций и их применение.

В настоящее время широко применяются серологические реакции с меченными тем или иным способом компонентами (антителами – АТ или антигенами – АГ). Они отличаются высокой специфичностью, позволяют быстро получить результаты, поэтому используются для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции – РИФ, иммуноферментный анализ – ИФА, радиоиммунный анализ –РИА.

В качестве меток используются:

1) флюорохромы – вещества, способные флюоресцировать при облучении ультрафиолетом (поглощают энергию света определенной длины волны и излучают свет большей длины волны): флюоресцеина изотиоцианат (зеленый цвет), фикоэритрин (оранжевый), родамин (красный); используются в РИФ;

2) ферменты: пероксидаза хрена, галактозидаза, щелочная фосфатаза; вызывают расщепление субстрата с образованием окрашенных продуктов при взаимодействии с хромогеном; используются для ИФА;

3) радиоактивные метки – используются в РИА.

РИФ (реакция Кунса) – основана на том, что антигены тканей или микроорганизмы после обработки иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах, что обнаруживается при люминесцентной микроскопии мазков. Т.о. обязательно используется люминесцентная микроскопия (т.е. данный метод является разновидностью микроскопического метода диагностики). Использование флюорохромов основано на том, что они способны вступать в химическую связь с антителами, не нарушая их иммунологической специфичности. Метод позволяет обнаружить микроорганизмы непосредственно в инфекционном материале, тканях животных и культурах клеток. Простота метода, не требующего выделения чистой культуры в сочетании с быстротой получения результатов, позволяют отнести РИФ в разряд экспресс-диагностики.

Различают 3 основные разновидности метода: 1) прямой; 2) непрямой; 3) непрямой с комплементом (антикомплементарная РИФ).

Прямая РИФ. Компоненты (ингридиенты).

Антигены тканей или микроорганизмы.

Флюоресцирующая (люминесцирующая) иммунная антисыворотка – содержит известные антитела (против искомого антигена), меченные флюорохромами.

Антигенами могут быть культуры бактерий, грибов, простейших; препараты из материала от больных (кал при холере, мокрота при коколюше); инфицированные культуры клеток, срезы тканей.

Постановка реакции.

1. Исследуемый материал наносят на предметное стекло и фиксируют (чаще всего в ацетоне, 10 мин, при комн. t0), высушивают 20 мин, 370С.

2. На фиксированный мазок наносят люминесцентную сыворотку, содержащую специфические антитела, меченные изотиоцианатом, 30 мин, 250С (во влажной камере).

Промывка буферным раствором, 10 мин, 250С.

Люминесцентная микроскопия: сначала при 40х, а затем – 90х (обращают внимание не только на наличие свечения, но и его интенсивность, характер распределения).

Учет реакции. «+» реакция – клетки светятся (видимый эффект) по периферии в виде каймы желто-зеленого цвета в люминесцентном микроскопе.

Недостатком прямого метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих антисывороток против каждого изучаемого антигена.

Непрямая РИФ проводится с использованием двух различных антисывороток. Вначале применяют немеченые АТ против искомого антигена, а затем образовавшиеся комплексы АГ-АТ обрабатывают люминесцирующей антисывороткой, содержащей меченые антитела против гамма-глобулинов того вида животного, которого иммунизировали при получении немеченой сыворотки (например, антиглобулиновая кроличья сыворотка, содержащая антитела к глобулинам кролика).

Если немеченая антисыворотка была получена путем иммунизации кроликов, то на втором этапе используют меченую антивидовую кроличью сыворотку, полученную путем иммунизации кроличьими гамма-глобулинами ослов или каких-либо других животных.

Таким образом, необходимо иметь только антивидовую флюоресцирующую сыворотку.

При постановке непрямой РИФ:

1) обработка препарата немеченой специфической антисывороткой 30 мин, 250С и промывка 10 мин, 250С – образуется несветящийся комплекс АГ-АТ (антитела покрывают антиген первым слоем);

2) обработка антивидовой меченной сывороткой 30 мин, 250С, промывка 10 мин, 250С – антиглобулиновые меченные антитела связываются со специфическими антителами, которые служат для них антигенами (меченные АТ покрывают искомый АГ вторым слоем: АГ-АТ-АТ+флюорохром), вызывая свечение при люминесцентной микроскопии (т.е. АГ становится видимым в люминесцентном микроскопе).

Антикомплементарная РИФ предполагает применение меченых АТ против комплемента морской свинки. Для реакции используется комплемент, который фиксируется на комплексе антиген-антитело. Добавление к такой системе антикомплементарной меченой сыворотки позволяет увидеть АГ по специфическому свечению в люминесцентном микроскопе.

При постановке РИФ с комплементом:

обработка препарата немеченой специфической антисывороткой и комлементом морской свинки 30 мин, 250С и промывка 10 мин, 250С – образуется несветящийся иммунный комплекс (АГ-АТ), на котором адсорбируется комплемент (АГ-АТ-комплемент);

обработка антикомплементарной меченной сывороткой (содержит антитела против глобулинов морской свинки) 30 мин, 250С, промывка 10 мин, 250С - комплекс АГ-АТ-комплемент взаимодействует с флюоресцирующим антителом к комплементу и полученный многокомпонентный комплекс (АГ-АТ-комплемент-АТ+флюорохром) светится в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Необходимо иметь только одну флюоресцирующую сыворотку – антикомплементарную.

Достоинством непрямой и антикомплементарной РИФ является использование лишь одной светящейся сыворотки (антивидовой или антикомплементарной) при обнаружении различных антигенов. Это значительно удешевляет реакцию. Но с другой стороны по мере усложнения процедуры РИФ возрастает и возможность ошибок. РИФ нельзя отнести и к числу высокочувствительных реакций. Не исключается возможность неспецифической адсорбции меченых АТ на препарате.

Для исключения ложноположительных результатов реакцию сопровождают рядом контролей (контроль с гетерологичным антигеном, контроль с неинфицированной культурой и т.д.). Применение лантаноидной метки (металлы лантаноидной группы) существенно повышает чувствительность метода.

Непрямой вариант РИФ можно использовать и для определения АТ в сыворотке больного. Для этого известный антиген (культура клеток, срезы тканей) наносят на предметное стекло и инкубируют в присутствии исследуемой сыворотки, а затем - в присутствии меченых флюорохромом антител к иммуноглобулинам человека (антисыворотка к глобулинам человека). Этот метод используют для выявления антинуклеарных антител при аутоиммунных заболеваниях и антител к некоторым вирусам.

Радиоиммунный анализ (РИА). Основан на том же принципе, что и ИФА, только вместо фермента вносится радиоактивная метка. Радиоактивность определяют по счетчику импульсов. Применение РИА связано с использованием сложной регистрирующей аппаратуры, и существенной биологической и экологической опасностью.

Иммуноблотинг. При постановке иммуноблотинга вначале препарат известного антигена фракционируют – разделяют методом электрофореза в агарозном геле на фракции (отдельные АГ). После этого гель накладывают на нитроцеллюлозную бумагу (фильтр), плотно прижимают к ней и создают электрическое поле, в результате происходит перенос фракций на бумагу (блоттинг). При этом сохраняется взаиморасположение фракций и их расстояние от старта (картина электрофореза). Далее обработку фильтра ведут также, как и при ИФА или РИА.

Учет результатов. Появление окрашивания фильтра в виде полос на тех местах, где располагались особые (специфические) фракции.

Характеристика возбудителей туберкулеза. Патогенез заболевания. Особенности иммунитета. Лабораторная диагностика туберкулеза. Использование пробы Манту для диагностики туберкулеза. Суть пробы и ее оценка. Препараты для специфической профилактики и лечения заболевания.

Tuberculum - лат. - бугорок. Туберкулез — инфекционное заболевание, которое вызывается микобактериями и характеризуется поражением легких, пищеварительного тракта, кожи, костей, мочеполовой системы. Характеристика возбудителя.

Возбудители туберкулеза относятся к роду Mycobacterium (myces - гриб), сем. Mycobacteriaceae, отд. Firmicutes. В основном, туберкулез вызывается 3-мя видами: Mycobacterium tuberculosis - это палочки человеческого типа, вызывают заболевания в 90 % случаев; M. bovis - палочки бычьего типа и M. africanum. Они отличаются по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам и патогенности.

Морфология: М. tuberculosis - тонкие длинные палочки, слегка изогнутые; M. bovis короткие толстые; M. africanum - тонкие длинные полиморфные палочки. Не образуют спор, жгутиков, капсулы.

Тинкториальные свойства: грам «+», но красятся с трудом. Они очень устойчивы к кислотам, спиртам. щелочам, поэтому их называют кислотоустойчивыми, т.к. они содержат до 40% жиров - это воск, миколовая, стеариновая кислоты. Простыми методами не красятся, поэтому их окрашивают специальным методом - методом Циля-Нильсена (окрашиваются в красный цвет).

Культуральные свойства: палочки человеческого типа являются облигатными аэробами, требовательны к питательным средам, растут на средах с добавлением яичного белка и глицерина (среда Левенштейна-Иенсева). В глицериновом бульоне растут в виде рыхлой пленки. На плотных средах дают желтоватые, бородавчатые колонии в R-форме, растут медленно 2-3 недели. Биохимические свойства: разлагают нитраты, мочевину, никотинамид. Антигенная структура: имеют большой набор белковых и липополисахаридных антигенов, которые участвуют в ГЗТ и обладают протективной активностью. Резистентность: туберкулезные палочки устойчивы во внешней среде, в пыли сохраняются 10 дней, в мокроте - до 10 месяцев. При кипячении погибают через 5 минут. Погибают при действии активированного раствора хлорамина и хлорной кислоты.

Эпидемиология заболевания. Туберкулез известен человечеству с давних времен. Туберкулез - социальная болезнь. Чаще болеют люди, живущие в плохих условиях.

Источник инфекции — больной человек. Эпидемическую опасность представляют больные с открытой формой туберкулеза, выделяющие возбудителя в окружающую среду. Пути передачи:

1) воздушно-капельный — основной путь передачи;

2) контактно-бытовой — реже (инфицированная посуда).

Можно заразиться через пищу (молоко больных коров), через плаценту от больной матери с прогрессирующей формой туберкулеза.

Патогенез и клиника. При заражении воздушно-капельным путем палочки чаще попадают в правое легкое. Чаще всего развивается туберкулез легких. В месте проникновения и размножения микобактерий в легких возникает экссудативное воспаление с последующим некрозом. Этот воспалительный очаг называется первичным туберкулезным комплексом (первичный аффект или гоновский очаг). Дальше процесс распространяется на плевру, лимфатические сосуды, регионарные лимфатические узлы (казеозный лимфаденит).

Инкубационный период: 3-8 недель. Для начальной стадии заболевания характерно повышение температура до 37С. озноб, потливость по ночам, появляется сухой кашель, снижается аппетит, работоспособность. При значительном поражении легких возникает кровохарканье (в легких образуются каверны) и легочные кровотечения. Если не лечиться, наступает смерть.

Иммунитет при туберкулезе нестерильный или инфекционный, т.е. он связан с присутствием живых микобактерий в организме. Противотуберкулезный иммунитет непрочен и сохраняется только при наличии в организме микобактерий.

Лабораторная диагностика.

Исследуемый материал: мокрота, промывные воды бронхов, моча, спинномозговая жидкость. Методы исследования: 1) бактериоскопический готовят мазки и красят по Цилю-Нильсену; такой метод эффективен только при высокой концентрации микобактерий в исследуемом материале; Для повышения концентрации используют различные методы “обогащения’: метод центрифугирования, метод флотации; 2) бактериологический: посев на среду Левенштейна-Иенсена и выделение чистой культуры микобактерий; для этого метода нужно 3-4 недели, т. к. растут микобактерии медленно; в качестве ускоренного метода используется метод Прайса - выращивание на предметном стекле в цитратной плазме: через 5-7 дней на стекле вырастают микроколонии, которые окрашивают по Цилю-Нильсену; если микобактерии высоковирулентны (т.е. обладают корд-фактором) колонии имеют вид ‘кос” или “жгутов”; 3) биологический - заражение морских свинок; 4) кожно-аллергические пробы Пирке или Манту с туберкулином (РРD белковый очищенный препарат из микобактерий туберкулеза) для выявления ГЗТ: туберкулин вводят внутрикожно, если в организме имеются живые микобактерии (у больного или вакцинированного человека), то на месте введения туберкулина через 48 час развивается местная воспалительная реакция (покраснение, уплотнение); инфильтрат (папулу) измеряют линейкой в мм; средний размер инфильтрата у лиц с поствакцинальной аллергией (вакцинированных людей) — 7-9мм, а у лиц с постинфекционной аллергией (зараженных ‘настоящими’ микобактериями)- 11-13мм; поствакцинальные пробы постепенно ослабевают, а постинфекционные — нет; лица с отрицательными пробами являются неинфицированными и их необходимо вакцинировать вакциной БЦЖ. Методом раннего выявления туберкулеза является флюорографический метод.

Лечение.

Химиотерапия; препараты 1-го ряда - изониазид, 11-го ряда - стрептомицин. Применяют также препараты, стимулирующие естественные защитные силы организма. Лечение 6-8 мес., в среднем 1 год.

Профилактика.

Общая профилактика: ранее выявление заболевания (своевременная флюорография, взятие на учет семей) и лечение, в случае необходимости — диспансеризация; про- ведение санитарно-гигиенических мероприятий. Специфическая профилактика: вакцинация новорожденных живой вакциной БЦЖ (на 5-7 день жизни). Ревакцинации делают через 5-7 лет до 30 лет (в 7, 1 2, 1 7 и т.д. лет). Вакцинные микобактерии приживаются в организме, образуя безвредные очаги и создают нестерильный иммунитет. Перед ревакцинацией проводят пробу Манту. Ревакцинацию проводят только лицам с отрицательной пробой. Если через 5 - 7 лет туберкулиновая проба положительна, это означает, что человек заразился ‘настоящими” туберкулезными палочками, и его не нужно вакцинировать БЦЖ.

Вакцинация на 80% предохраняет людей от заболевания. Если человек заражается, то туберкулез у него протекает доброкачественно. т Т-лимфоциты, имеющие специфическую чувствительность

 

Билет 17.

Основные принципы культивирования бактерий. Требования, предъявляемые к питательным средам. Классификация питательных сред по назначению, их примеры. Состав и назначение МПА, МПБ, кровяного агара, сред Эндо, Левина и Плоскирева.

Для культивирования необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О2) или создание бескислородных условий для анаэробов; 4) определенной время для выращивания (чаще – 24 час).

Требования к питательным средам.

а) среды должны быть питательными - содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества;

б) иметь определенное значение рН; для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4;

в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды;

г) быть изотоничными - осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки;

д) быть стерильными для получения чистой культуры;

е) содержать достаточное количество Н2О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии;

ж) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, для аэробов rH2 – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;

з) быть прозрачными;

Классификация питательных сред.

По консистенции среды делят на:

а) жидкие: пептонная вода (ПВ), мясопептонный бульон (МПБ);

б) полужидкие: полужидкий мясопептонный агар (МПА) и др.;

в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка;

г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок;

д) сухие – гигроскопические порошки, выпускаемые промышленностью;

Для уплотнения сред используют агар, желатин или селикагель. Агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он образует в воде гели, которые плавятся при температуре 100 С и застывают при 45 С. К полужидким средам агар добавляют в количестве 0,5% (0,3-0,7%), к плотным – 1,5-2%.

По составу среды делят на:

а) естественные – натуральные продукты (яйца, овощи), животные ткани, желчь, сыворотка крови;

б) искусственные – среды, приготовленные из различных настоев или отваров с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ;

в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях.

По назначению среды делят на:

а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; простые среды служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;

б) специальные (сложные) - используют для тех микроорганизмов, которые не растут на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ и МПА, кровяной МПА, асцитический МПБ;

в) элективные (избирательные) – используют для определенных видов; создаются оптимальные условия для этих видов, а другие виды не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза);

г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается так, чтобы выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.

Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.

Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов).

Эти среды используются для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae. Они позволя ют отличить патогенные микроорганизмы от кишечной палочки

Мясо-пептонный агар

К 1л мясной воды прибавляют 1г пептона и 0,5г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,2-2г измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и назначения среды). После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют. Приготовленный агар фильтруют или декантируют, разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре +1200С в течение 20 минут.

Сахарный бульон (бульон с глюкозой)

К 1л мясопептонного бульона нейтральной реакции прибавляют глюкозу в количестве 0,25мг-2г. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при температуре +1150С 30 минут.

Кровяной агар - специальная бактериол. среда, служащая для выделения бактерий (напр., стрептококков) и установления их гемолитической активности. Для приготовления К. а. к расплавленному и охлажденному до 45°С (не выше) 2% МП А добавляют 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека, смешивают и разливают по чашкам Петри, выдерживают сутки в термостате на возможную бактер. контаминацию. К-ру засевают штрихом или бляшкой.

⇐ Предыдущая12131415161718192021Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: