Инвазия нефагоцитирующих клеток

По сравнению с фагоцитирующими клетками, которые имеют большой опыт в части усвоения бактериальных патогенов, нефагоцитирующие клетки обычно не способны поглощать большие частицы. Однако, некоторые бактериальные патогены могут стимулировать их собственный захват (вторжение) этими клетками, позволяя патогену войти в защищенную нишу и, в некоторых случаях, позволяя патогену пройти через клеточные барьеры, например кишечный эпителий или гематоэнцефалический барьер. Фагоцитоз и бактериальное вторжение кажутся механически сходными: оба процесса начинаются с лиганд-рецепторных взаимодействий, которые активируют передачу хозяйских сигналов, для вовлечения механизмов регулирующих состояние актинового цитоскелета и приобретения необходимой силы, чтобы усваивать частицу в мембран-связанную вакуоль. Однако, агрессивные бактерии, кажется, индуцируют два главных типа интернализации: механизм типа "застежки - молнии", использующий прямой контакт между бактериальными лигандами и клеточными рецепторами, которые последовательно окружают организм (путь используемый например Yersinia и Listeria), и триггерный механизм ("спусковой механизм"), при котором бактерии посылают сигналы клетке, чтобы стимулировать выпячивание мембраны и цитоскелетную реаранжировку, что кончается макропиноцитозом и фактически пассивным входом бактерий. Эта стратегия используется Salmonella и Shigella.

Бактериальные компоненты, которые опосредуют передачу сигналов и вторжение Salmonella и Shigella в культурах клеток, удивительно схожи, хотя механизмы используемые бактериями этих двух родов для вторжения также имеют и заметные различия. Бактерии обоих родов используют систему секреции III типа.

У Salmonella, гены кодирующие систему секреции и эффекторные белки известны как inv-spa комплекс и расположены на хромосоме, формируя "островок патогенности”, кластер генов патогенности, встроенных в один участок генома.

У Shigella, mxi-spa система секреции и гены которые кодируют ее секретирующиеся белки (IpaA, -B, -C, и -D) найдена на большой плазмиде вирулентности.

Секреция этих медиаторов бактериальной инвазии активирует хозяйские сигнальные пути, что заканчивается захватом бактерии. В отличие от адгезии EPEC, которые стимулируют, фокусную реорганизацию актинового цитоскелета под бактериями, Shigella и Salmonella стимулируют крупные перестановки клеточного актина, которые приводят к образованию больших мембранных выступов, подобно "мембранной ряби" вызываемой, например, некоторыми факторами роста или онкогенами. Кульминацией процесса является формирование, связанных с мембраной вакуолей, которые в случае Shigella впоследствии лизируется с выходом бактерий в цитоплазму.

Какие клеточные события, приводящие к передачи сигналов, связаны с инвазией Salmonella typhimurium? Было ясно продемонстрировано увеличение внутриклеточной концентрации Ca²⁺ и увеличение продукции инозитолфосфата. Кажется вероятным, что бактерии стимулируют хозяйскую фосфолипазу C, которая стимулирует продукцию инозитолтрифосфата, что в свою очередь приводит к мобилизации Ca²⁺ от его интрацеллюлярных депо. Эта идея коррелирует с ролью кальция и фосфоинозитидов в воздействии на многочисленные actin-связывающие белки, некоторые из которых (actinin, talin, ezrin) регистрируются на участках вхождения бактерий в клетку. Тирозинкиназовые ингибиторы не блокируют вторжение Salmonella.

В случае Shigella, белки хозяина, которые становятся, тирозинфосфорилироваными при внедрении, включают cortactin, pp125FAK и paxillin. Например, кортактин это актин-связывающий белок и субстрат для без-рецепторной тирозин-киназы Src. Src также активизирована во время вторжения Shigella и солокализуется в участке входа. T-plastin, который является, actin-связывающим белком, кажется, играет центральную роль в посредничестве бактериального проникновения, возможно, связывая недавно сформированные актиновые нити в мембранных выростах. Другой actin-связывающий белок, vinculin, солокализован в участке внедрения и может быть коиммунопреципитирован с IpaA. Однако, бактерии (шигеллы), которые не экспрессируют IpaA тем не менее используют vinculin, но избегают использования a-actinin(а), vinculin-связывающего белка. Эти результаты говорят о том, что IpaA осуществляет vinculin активацию после ряда последовательных шагов.

В клетках млекопитающих, главные реаранжировки актинового цитоскелета под влиянием рецепторной или другой стимуляции ведут к появлению или мембранного волнения, с формированием филоподий, или к формированию напряжения актиновых волокон. Кроме уачстия актинсвязывающих белков эти перестановки контролируются определенными малыми GTP-связывающим белками, принадлежащие к Ras суперсемейству, а именно, Rac, Rho, и CDC42. Таким образом ожидалось, что агрессивные бактерии будут зависеть от этих молекул, чтобы добиться собственного захвата, и действительно Salmonella требует CDC42, но не Rac или Rho для вторжения, с другой стороны, Shigella нуждается в Rho, но не Rac или CDC42.

Процессы внедрения Salmonella и Shigella в неполяризованные эпителиальные клетки in vitro кажется морфологически очень схожи. Однако, одно главное различие в том, что Salmonella взаимодействуют с апикальной эпителиальной поверхностью, а с другой стороны Shigella вступают в контакт только с базолатеральной поверхностью, хотя оба патогена проникают через один и тот же кишечный эпителий. Интегрин 51, который найден только на базолатеральной поверхности эпителиоцитов, является рецептором для Shigella для вторжения в культуру CHO клеток, но никакой поверхностный клеточный рецептор не был идентифицирован пока для Salmonella. Как Shigella добираются к базолатеральной поверхности? Изучения in vivo показывают, что один главный участок входа это - М клетки Пейеровых бляшек. М клетки специализированные эпителиальные клетки, способные к усваиванию инертных частиц в их апикальной поверхности и доставке их к подлежащим макрофагам. Посредством клеток этого типа, которые используются иммунной системой для получения образцов антигенов с поверхности эпителиальных тканей кишечника, Shigella, может пересечь эпителий, чтобы вторгнуться в энтероциты с их базолатеральной поверхности. Альтернативно, перемещение может быть осуществлено между эпителиальными клетками, как только связи между клетками открываются, например, для перемещения нейтрофилов в ответ на присутствие Shigella на апикальной поверхности кишечных клеток. Таким образом, и М клетки и парацеллюлярный путь позволяет Shigella достигать и инфицировать базолатеральную поверхность эпителиальных клеток кишечных крипт. Salmonella также может осуществлять вторжение через М клетки in vivo, по крайней мере у мышей. Однако, это приводит к цитотоксическому эффекту и в результате к деструкции М клеток и вторжению в смежные энтероциты в обе и в апикальную и базолатеральную сторону.

Возможно лучше была изучена система вторжения - у Yersinia. Yersinia enterocolitica и Y. pseudotuberculosis имеют внешний мембранный белок, invasin, который опосредует прикрепление и вход в эпителиальные клетки. Через связывание с субъединицей b₁- интегринов на поверхностях клетки, invasin обеспечивает бактериальный захват посредством механизма подобного застежке - молнии, мембрана клетки хозяина застегивается вокруг бактерии, которая при этом входит в клетку. Механизмы хозяйской сигнальной трансдукции используется и в инвазин опосредованном входе, потому что, например, ингибиторы тирозинкиназы предотвращают вход. Актин хозяйской клетки также необходим для этого процесса, но местные перестановки цитоскелета около участка входа - не так драматичны как в случае Shigella и Salmonella. Факт, что интрацитоплазматический домен субъединицы b₁-интегринов взаимодействует с цитоскелетом, через связывание с актинсвязывающими протеинами типа talin и a-actinin и тот факт, что актин требуется для входа, ведет к предположению, что в течении интернализации требуется прямая ассоциация интегринов с цитоскелетом. Однако, мутации, которые уменьшили взаимодействие интегрина с цитоскелетом, увеличили бактериальную интернализацию, в то время как мутации, которые разрушили NPIY последовательность (N, Asn; P, Pro; I, Ile; Y, Tyr) [привязка к NPXY мотиву (последовательности), где X представляет любую аминокислоту, участвующему в локализации рецепторов, являющихся посредником эндоцитоза к клатрин-покрытым нишам], терминирующую интегрины, вели к дефициту бактериального захвата. Фактически, большие решетки клатрина и AP2 адаптерных комплексов сформированы под связанными бактериями на ранних стадиях интернализации, что предполагает интегрин опосредованную интернализацию, разделяющую общие особенности с клатрин-опосредованным эндоцитозом. Разные виды Yersinia имеют по крайней мере две других молекулы, Ail и YadA, которые могут приводить к вторжению в культуры эпителиальных клеток; однако, относительно их способа действия известно намного меньше.

В дополнение к системам вторжения в эпителиальные клетки, разновидности Yersinia развили сложные механизмы, для избежания поглощения фагоцитирующими клетками. Антифагоцитарная стратегия подразумевает использование Yop белков, которые также являются примером системы секреции III типа. После контакта бактерий с поверхностью клетки хозяина, несколько Yop вводятся в фагоцитирующие клетки и ингибируют фагоцитоз. YopE парализует клеточный актиновый цитоскелет; его цель неизвестна, но YopE имеет соответствие с экзоферментом S (ExoS) Pseudomonas aeruginosa. ExoS также секретируется III типом секреции, и проявляет тот же самый цитотоксический эффект как и YopE, когда экспрессируется в рекомбинантных штаммах Y. pseudotuberculosis, предполагают, что эти два белка имеют одну и ту же цель. ExoS модифицирует малые G белки, вовлеченные в регулирование актиновой сети. YopH также вносит вклад в блокаду фагоцитоза. YopH это тирозинфосфотаза широкого спектра действия, которая дефосфорилирует несколько белков хозяина, прерывая раннюю фосфотирозиновую передачу сигналов ассоциированных с фагоцитозом. Это, кроме того, ингибирует и Fc рецептор-опосредованный кислородный взрыв. Другой Yop, YopO (также называемый YpkA) вероятно также сталкивается с некоторыми путями сигнальной трансдукции эукариотической клетки, хотя его субстраты не были идентифицированы. YopO/YpkA имеет соответствие с сериновой и треониновой киназами клеток млекопитающих, и подобно YopH обнаруживается у внутренней поверхности плазматической мембраны эукариотических клеток.

In vivo, вслед за проникновением в кишечник, Yersinia захватываются М клетками, и инвазин играет критическую роль в этом процессе. После транслокации через интестинальный барьер, для того чтобы избегать поглощения фагоцитирующими клетками, находящимися под М клетками, Yersinia может мешать этому при помощи Yop. Таким образом, бактерии остаются в экстрацеллюлярном положении, что позволяет их выживание и умножение в виде экстрацеллюлярных микроколоний в лимфоидных тканях. Фагоцитоз же обычно кончается смертью бактерий.

Таким образом, имеются многочисленные примеры использования бактериальных продуктов секретирующихся контакт-опосредованной системой секреции III типа, для использования с целью - от усиления адгезии (EPEC) и инвазии (Shigella, Salmonella) до повреждения клетки и блокады фагоцитоза (Yersinia). У Грамположительных микроорганизмов не было обнаружено схожих систем.

Среди грам+ бактерий инвазивные механизмы были детально изучены только у Listeria monocytogenes. Будучи пищевыми патогенами они проникают в различные клетки и ткани млекопитающих на протяжении инфекционного процесса или в экспериментах на культурах клеток.

Поверхностный бактериальный протеин – интерналин, опосредует вход в культуре интестинальных эпителиальных клеток. Интерналин содержит многочисленные копии 22-богатых лейцином повторяющихся аминокислотных последовательностей (LRR), близких по строению со многими эукариотическими протеинами обычно вовлеченными в белок-белковые взаимодействия. СООН-терминальный регион интерналина содержит последовательность LPXTG вида (L, Лей; T, Thr; G, Gly) позволяющую ковалентное заякоривание поверхностных протеинов грам+ бактерий к бактериальной клеточной стенке. Это происходит после расщепления T-G связи и заякоривания T остатка к пептидогликану.

Рецептором для интерналина на клетках млекопитающих является E-кадерин, трансмембранный клеточный адгезивный белок обычно вовлеченный в межклеточные взаимодействия через свой экстрацеллюлярный домен. Е-кадерин является не единственным гетерофильным доменом для интерналина; интегрин a_Eb₇ интраэпителиальных лимфоцитов также связывает его. Интрацитоплазматический регион Е-кадерина, который через комплекс с катенинами, связан с цитоскелетом, является критическим для гомофилических взаимодействий в межклеточной адгезии. Интересно, что нет необходимости во взаимодействии между двумя вышеозначенными белками клеток млекопитающих. Который из них непосредственно необходим для входа бактерий в клетку неизвестно.

Морфологические события, связанные с входом L. monocytogenes значительно отличаются от макропиноцитоза, вызываемого Shigella и Salmonella и более напоминают о механизме застежки - молнии, установленном для Yersinia invasin-integrin(овом) взаимодействии. Цитоскелетные перестановки критически важны и для интернализации Listeria. Среди событий связанных с передачей сигналов, которые происходят между начальным контактом и перестановками в актиновом цитоскелете – важна активация липидкиназы p85/p110. Эта активация требует InlB белка, тирозинфосфорилирование в клетке хозяина, и ассоциации p85 с по крайней мере одним тирозинфосфорилированным белком. В чем заключается посредничество этой фосфатидилиназитол 3-киназы (PI 3-kinase) в захвате неизвестно. Одна привлекательная возможность заключается в том, что этот липидный продукт PI-3 киназы непосредственно действуют на актин, через концы актиновых нитей как предварительно показано на модели тромбоцитов.