Внутриклеточная жизнь бактериальных патогенов

Использование функций хозяйской клетки продолжается когда бактериальные патогены становятся интрацеллюлярными паразитами. Почти все инвазивные бактерии попадают в мембран-связанную вакуоль и эта стадия является частью их инвазионного процесса, но последующие события для разных бактерий могут быть различными. Некоторые бактерии выживают в вакуолях, которые при этом сливаются с лизосомами, однако мало известно о механизмах этих процессов. Другие обладают механизмами запрещения слияния фагосом с лизосомами, третьи персистируют в защищенных нишах внутри хозяйской клетки, наконец четвертые лизируют вакуоль и выживают внутри цитоплазмы.

Жизнь в вакуоли. Salmonella интернализует обе группы клеток и фагоцитирующие и нефагоцитирующие путем макропиноцитоза. Они часто сохраняются в клетке в широких мембран-связанных вакуолях, и они экспрессируют несколько генных продуктов, за счет которых увеличивают выживаемость, нейтрализуя лизосомальные киллинговые механизмы, которые опосредуются например катионными пептидами. Внутри эпителиальных клеток, вакуоль с S. typhymurium кажется отклоняется от обычного эндоцитарного пути и после периода задержки (lag-фазы), бактерия реплицируется в ней. С этими вакуолями ассоциированы хозяйские филаментозные структуры, которые содержат лизосомальные гликопротеины; роль этих структур неясна, но Salmonella имеют по крайней мере один фактор вирулентности, который является необходимым для формирования таких филаментозных структур.

Общее свойство среди патогенов, которые остаются в пределах мембран-связанных вакуолей - их способность избегать слияния с лизосомами, хотя механизмы которые бактерии используют для этого обычно отличаются. Например, вакуоли содержащие Mycobacteria остаются в пределах ранних эндосомальных компартментов, таким образом избегая процесса развития в лизосомы. Вакуолярная аденозин трифосфотаза, которая является ответственной за закисления везикул, не включается в интрацеллюлярные мембраны вакуолей, содержащих например M. avium так, что вакуоли остаются неподкисленными, что является необходимой предпосылкой для активации нескольких лизосомальных ферментов с деградирующей активностью. Большинство лизосомальных маркеров, не достигает Mycobacterium -содержащих везикул.

Chlamydia trachomatis, облигатный внутриклеточный патоген, проживает в пределах вакуолей, которые остаются полностью отсоединенными от главного эндоцитарного маршрута. Хламидиальные включения не содержат никаких определенных вакуолярных маркеров, но приобретают и включают в вакуоли сфингомиелин, вероятно, перехватывая его из пузырьков экспортирующихся по секреторному пути. Рост Chlamydia в вакуоли требует аденозинтрифосфата (АТФ), который накачивается в вакуоль из цитоплазмы клетки хозяина неизвестным механизмом.

Legionella pneumophila, агент болезни Легионеров, также населяет уникальную интрацеллюлярную нишу в пределах мембран-связанной вакуоли. Они попадают в фагоциты необычным для фагоцитоза механизмом, называемым "наматывающий фагоцитоз", в течение которого псевдоподии фагоцита наматываются вокруг бактерии до тех пор, пока микроорганизм не поглощается. После интернализации, хозяйские митохондрии сосредотачиваются вокруг бактериальной вакуоли, но позже они замещаются рибосомами. Рибосомы связаны с хозяйским эндоплазматическим ретикуломом. Кажется, что вакуоль с Legionella соединяется с шереховатым эндоплазматическим ретикуломом, чтобы создать интрацеллюлярную нишу, благоприятную для нее. Несколько бактериальных генов, включая icm и dotA кажется, являются критическими для внутриклеточного выживания и роста Legionella.

Другие возможные механизмы, которыми патогены влияют на созревание вакуолей содержащих патогены, только начинают изучаться. Например, везикулярный трафик обычно опосредован протеинами семейства малых GTP-связывающих белков называемых Rab белками. Одна возможность состоит в том, что вакуоли содержащие бактерии взаимодействуют с Rab белками или их исполнительными элементами, таким образом изменяя их транспорт и весь трафик вакуоли. Другой потенциальный механизм - связывание вакуолярных поверхностных рецепторов, что изменяет вакуоль, и не дает распознать ее чтобы превратить в лизосому. Развитие новых методов, как например изоляция вакуолей, содержащих интрацеллюлярные патогены и использование конфокальной микроскопии, чтобы маркировать вакуолярные мембраны, вместе с идентификацией бактериальных генов, которые опосредуют эти процессы, дадут информацию относительно этих механизмов.

Спасение из вакуоли и "межклеточное" распространенение. Не все внутриклеточные бактерии остаются в пределах вакуоли. Shigella, Listeria, и Rickettsia быстро получают доступ к цитозолю, где они и реплицируются. В случае Shigella, бактериальный фактор который нарушает мембрану вакуоли - IpaB, один из секретируемых белков используемых для вторжение в клетки, но механизм лизиса - неизвестен. Listeria используют поро-формирующий токсин, listeriolysin O.

Когда эти три бактериальных вида проникают в цитоплазму, они используют фенотипически схожие механизмы, чтобы продвигаться через цитозоль. Непрерывный процесс приводящий к полимеризации актина имеет место на одном из полюсов бактерии и обеспечивает движущую силу для передвижения. Актин собирается в виде хвоста полимеризованного (F) актина, который постоянно сохраняется в пределах цитозоля ("актиновый хвост") в то время как бактерии двигаются вперед. В этом хвосте, короткие и беспорядочно ориентирование нити, с зазубренным (быстро полимеризующимся) концом, ориентируемым к бактерии, указывают, на то что полимеризация актина начинается на бактериальной поверхности. Бактериальная актин-опосредованная подвижность не имеет никакой связи с бактериальным хемотаксисом; скорее, это явление близко напоминает о других клеточных актин-опосредованных моторных событиях, типа перемещения нейтрофилов к участку инфекции или метастазирование раковых клеток. В этих случаях, полимеризация актина имеет место в ведущем крае перемещающейся клетки. Однако, молекулярные механизмы этих клеточных событий остаются неуловимыми. Это объясняет, почему бактериальная подвижность, после ее обнаружении, получила много внимания. Потому что это обеспечивает упрощенный и генетически манипулируемый доступ к системе, чтобы изучить это сложное явление у эукариот.

Актин-опосредованная подвижность была ассоциирована с наличием единственного бактериального белка: ActA в случае Listeria и IcsA (также называемый VirG) для Shigella. ActA – поверхностный белок состоящий из 610-аминокислотных остатков, характеризующийся наличием центральной области, содержащей богатые пролином повторяющиеся участки. IcsA - внешний мембранный белок [120-kD], который также имеет область повторов в своей структуре, хотя и богатой лейцином. Одна интересная особенность этих двух белков - их полярное распределение на бактериальной поверхности. Возникновение полярности в распределении ActA связано с процессом репликации бактериальной ДНК. Известно, что для Shigella, протеаза SopA вносит вклад в полярность распределения ее белка. Полярное распределение этих белков определяет участок для сборки актиновых нитей и направления движения, при этом бактерии демонстрируют способность нацеливать белки к специфическим точкам локализации, чтобы выполнить определенные программы в направлении движения.

Как ActA и IcsA опосредуют сборку актиновых волокон - более интенсивно изучалась для ActA с использованием систем свободных от клеток (типа яичный экстракт Xenopus или экстракт из тромбоцитов), которые поддерживают актин-опосредованную бактериальную подвижность. Генетический анализ показал, что NH₂-терминальная область ActA необходима и достаточна для движения, а центральная пролин-богатая область увеличивает эффективность процесса, при этом COOH-область не играет никакой роли. Предполагают, что ActA использует актин-связывающий белок или должен быть сам модифицирован внутри хозяина, чтобы взаимодействовать с актином, или возможно используются оба механизма. Очищенный ActA связывает VASP, клеточный белок, который связан с микронитями, и который может связывать профилин, маленький actin-связывающий белок, который играет критическую роль в контроле целлюлярной сборки актина. Таким образом VASP может обуславливать близость бактерий к соответствующим полимеризационным профилин/актиновым комплексам. Однако, в инфицированной клетке, VASP используется пролин-богатой областью ActA и может таким образом рассматриваться как не абсолютно необходимый. Также вовлечены в процесс - Arp2 и Arp3, два актино-подобных белка клеток млекопитающих, которые могут взаимодействовать с актином и обеспечивать связь между ActA и актином.

Начальные модели для ActA-опосредованной агрегации F-актина были в значительной степени основаны на идее что этот белок образует ядро полимеризации, или затравку, для актиновых мономеров. Хотя это - все еще не доказано окончательно, но привлекательная возможность, в настоящее время имеются некоторые свидетельства для этого. Другая возможность состоит в том, что ActA управляет движением непосредственно или косвенно генерируя или регулируя готовность свободных колючих концов актиновых нитей.

Использование актина бактериями, которые реплицируются внутри цитозоля - хороший пример использования клеточных компонентов бактериальным патогенами. Учитывая, что актиновый цитоскелет также может быть использован в течение интернализации и даже прилипания, ясно, что патогены развили широкий диапазон механизмов, чтобы управлять этой высоко динамичной цитоскелетной сетью. Это, в свою очередь, указывет на длинный коэволюционный путь между клетками и патогенами.

Обычно, когда внутриклеточные бактерии активно реплицируются внутри клетки хозяина, клетка умирает, причем часто путем лизиса. Это приводит к освобождению бактерий, которые вновь вторгаются в другие клетки или захватываются фагоцитирующими клетками. Для Shigella и Listeria, важным последствием актин-опосредованного движения является прямое распространение по направлению к соседним клеткам. При достижении плазматической мембраны, эти бактерии стимулируют формирование выпячиваний которые инвагинируют в соседнюю клетку, что приводит к формированию двух-мембранных вакуолей, содержащих бактерии. После лизиса вакуолей, бактерии начинает новый цикл инфекции. Поглощение содержащего бактерии выпячивания соседней эпителиальной клеткой требует присутствия адгезивных молекул, например E-кадерин, по крайней мере в случае Shigella. Это прямое межклеточное распространение позволяет бактериям распространятся в пределах тканей, в то же время позволяя бактериям оставаться защищенными от бактерицидных клеток хозяина или от таких гуморальных факторов как циркулирующие антитела или комплемент.

Факторы инвазии.

К этой группе факторов относят ряд ферментов продуцируемых бактериальными клетками. Большинство из них принадлежат к классу гидролаз.

Многие виды патогенных бактерий (C. perfringens, C. tetani, V. cholerae, P. aeruginosa, коринебактерии, бактероиды, микоплазмы) образуют нейраминидазу, или сиалидазу, гидролизующую соответствующие гликозидные связи в олигосахаридах, коломиновой кислоте, гликоконьюгатах (гликолипиды, гликопротеиды). В частности этот фермент отщепляет от вышеозначенных макромолекул остатки сиаловых (нейраминовых) кислот, находящихся в терминальном положении и связанных a - гликозидными связями. Сиаловые кислоты представляют собой N-ацетил производные нейраминовой кислоты, которая в свою очередь состоит из остатков Д-маннозамина и пировиноградной кислоты.

Этот белок представлен одной полипептидной цепью с молекулярной массой порядка 100 кД и обладает индуктивным характером синтеза.

- Сиалосодержащие гликоконьюгаты содержатся в муцине и секретах слизистой, придавая им вязкость, затрудняющую прохождение микроорганизма к эпителиоцитам.

- Содержаться на поверхности клеточных оболочек животных тканей. Например в составе гликопротеинов эритроцитов. Потеря 20-60% сиаловых кислот приводит к изменению скорости миграции эритроцитов.

- Нарушение межклеточного взаимодействия

- Сиаловые кислоты могут определять отрицательный заряд на чувствительных клетках, что в случае их потери приводит к изменению поверхностного заряда мембран и влияет на транспорт активных ионов

- Снижение фагоцитарной активности лейкоцитов

- Потеря иммуноглобулинами комплементсвязывающей активности.

Гиалуронидаза образуется бруцеллами, стафилококками, стрептококками, дифтерийными бактериями, холерными вибрионами, протеями, синегнойной палочкой, клостридиями вызывающими газовую гангрену и другими микробами. Субстратом для этого фермента является гиалуроновая кислота - высокополимерное соединение, повторяющейся единицей которого является дисахарид, состоящий из остатков N - ацетилглюкозамина и Д - глюкуроновой кислоты, соединенных b (1-3)-связью. Дисахаридные единицы соединены b (1-4)- связью, так что в гиалуроновой кислоте чередуются связи двух типов. Эта кислота растворима в воде, в которой она образует очень вязкие растворы. Гиалуронидаза катализирует гидролиз b (1-4)- связи, что сопровождается понижением вязкости раствора.

Повреждения гиалуроновой кислоты сопровождается потерей свойственных ей функций. В организме этот кислый мукополисахарид входит в состав внеклеточного основного вещества большинства видов соединительной ткани, содержится в клеточных оболочках или находится вблизи них, в больших количествах находится в синовиальной жидкости, где отвечает за смазку трущихся поверхностей и стекловидном теле глаза. Это желеподобное, липкое, скользкое и вязкое вещество служит своеобразной межклеточной смазкой и одновременно лабильным цементирующим материалом. Так же отвечает за удержание воды, связывание катионов, регуляцию диффузии, фибриногенез.

Другой целью для этого же фермента может быть хондроитин, сходный по своей структуре с гиалуроновой кислотой, отличающийся тем что вместо N- ацетилглюкозамина он имеет N - ацетилгалактозамин. Это минорный компонент внеклеточного материала, но его сернокислые эфиры, которые также могут быть мишенью для гиалуронидазы, хондроитинсульфаты А и С - служат основными структурными компонентами хрящевой и костной ткани, роговицы и некоторых других типов соединительной ткани позвоночных.

Лецитиназа или лецитоветилаза, в виде внеклеточного фермента образуется некоторыми клостридиями, холерным вибрионом, коклюшной палочкой, листериями. Этот фермент гидролизует фосфоглицерид фосфатидилхолин (старое название лецитин). Наряду с фосфатидилэтаноламином является главным липидным компонентом большинства мембран в клетках животных и человека.

Протеолитические ферменты.

Стафилококки, холерные вибрионы, некоторые патогенные грибы (например рода Candida) образуют эндо- и экзоклеточную коагулазу, сходную с лейцинаминопептидазой (a - аминоацил-пептидгидролазой) синтезируемой стенкой тонкого кишечника человека. Коагулаза катализирует гидролиз пептидных связей. К подобным гидролазам относят также фибринолизин, или стрептокиназу, - экзофермент, образуемый стрептококками, стафилококками, холерным вибрионом, иерсиниями, синегнойной палочкой. Этот фермент способен растворять фибрин. Другими экзоферментами, проявляющими свойства факторов агрессии за счет гидролиза белков, относят клостридиальную протеиназу В, стрептококковую протеиназу, коллагеназу отдельных клостридий, расщепляющую богатый пролином и глицином коллаген сухожилий, нейтральную протеиназу синегнойной палочки и других бактерий.

Ряд болезнетворных бактерий образует протеазы, катализирующие реакции гидролиза иммуноглобулинов. Например, виды Neisseria и Streptococcus sanguinus могут расщеплять местно накапливающиеся секреторные антитела типа IgA, предотвращая тем самым опсонизацию и фагоцитоз бактерий.

DNAзы – осуществляют гидролиз молекул ДНК и РНК на олигонуклеотиды и мононуклеотиды с 3’ - фосфатного конца фосфодиэфирных связей. Примеры: cтрептодорназа - стрептококков и стафилококковая эндонуклеаза.

Из числа гидролаз заслуживает также внимание уреаза - внеклеточный фермент, образуемый бруцеллами, некоторыми криптококками, протеем. Этот фермент катализирует реакцию распада мочевины до диоксида углерода и аммиака. Что ведет к защелачиванию внутренних сред макроорганизма и прямому токсическому воздействию аммиака. Особенно сильно его токсическое воздействие в отношении центральной нервной системы. Токсичность аммиака обусловлена тем, что он способствует восстановительному аминированию a-кетоглутаровой кислоты в митохондриях до глутаминовой кислоты, что способствует удалению a-кетоглутаровой кислоты из цикла трикарбоновых кислот и приводит к подавлению клеточного дыхания и другим последствиям.

Другой группой ферментов патогенности является группа лиаз. Среди лиаз можно отметить эндо- и экзоклеточные карбоксилиазы, продуцируемые различными энтеробактериями и псевдомонадами. Эти ферменты декарбоксилируют кислоты, включая аминокислоты, и выступают преимущественно факторами агрессии. При декарбоксилировании аминокислот образуются так называемые трупные яды или первичные амины, которые проявляют обще токсическое действие на организм. Например из аргинина образуется диамин – путресцин, а из лизина кадаверин.

Из других ферментов инвазии можно назвать эндо - и экзоклеточные гемолизины стафилококков, стрептококков, некоторых клостридий и грибов. Они катализируют реакции распада эритроцитов. b-гемолитические стрептококки (наряду со стрептококками из групп A, C, G) образуют стрептолизины О и S с молекулярной массой около 10 кД. Лейкоцидины стафилококков, стрептококков, пневмококков, псевдомонад лизируют тканевые клетки и лейкоциты. Так мишенью для стафилококкового лейкоцидина выступает трифосфоинозитид локализующийся в мембране лейкоцитов.

Лекция N 2

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: