Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска

Приготовление мазка

 

 

1) с жидкой питательной среды 2) с плотной питательной среды

культуру берут петлей и каплю наносят на предметное стекло наносят

непосредственно на стекло (без NaCl) небольшую каплю NaCl, в которой

эмульгируют исследуемый материал

и распределяют на площади около 2 см²

 

Высушивание

 

на воздухе высоко над пламенем спиртовки

мазком вверх

 

Фиксация

в процессе фиксации микробные клетки погибают, этим достигается безопасность работы с ними; убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители, чем живые; в фиксированном мазке клетки прикрепляются к стеклу и не смываются при последующей обработке.

Методы

 

физическийхимический

- над пламенем спиртовки мазком - более щадящий по сравнению

вверх (3 раза круговыми движениями) с физическим: мазок погружают

в фиксатор (этанол, ацетон, формалин

и др.) на определенное время

Окраска

Методы

 

простыесложные

(ориентировочные) (дифференцирующие)

1) окрашивают одним красителем 1) используют несколько красителей

анилинового ряда - основным или (основная и вспомогательные краски,

кислым: - кислый фуксин обесцвечивающие жидкости (этанол)

- эозин - метод Грама

- метиленовый синий - Нейссера

- генциановый фиолетовый - Гинса-Бурри

- Ожешко

2) используются для изучения 2) используются для определения

морфологии микроорганизмов морфологии, химического состава,

структуры микробных клеток

 

Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.

Методика окраски по Граму:

1 этап. Используется основная краска генциановый фиолетовый, затем раствор Люголя. Образуется прочное комплексное соединение «генциановый фиолетовый + йод». Все микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

2 этап. Обработка этанолом (дифференциация)

 

одни микробыдругие микробы

сохраняют комплекс генциановый теряют комплекс генциановый

фиолетовый + йод, не обесцвечиваются фиолетовый + йод, обесцвечиваются.

3 этап. Окраска фуксином

 

одни микробыдругие микробы

остаются сине-фиолетовыми, окрашиваются в красный цвет,

грамположительные: грамотрицательные:

1. Все кокки за исключением 1. Гонококки и менингококки

гонококков и менингококков

2. Все спорообразующие палочки 2. Большинство неспорообразующих

палочек

3. Из неспорообразующих бактерий 3. Спириллы

туберкулезная и дифтерийная палочки

4. Актиномицеты 4. Риккетсии

5. Грибы 5. Микоплазмы

 

Окраска по методу Грама не используется при изучении спирохет, простейших и вирусов.

 

Сущность метода окраски по Граму: отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У Гр+ бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, Гр+ бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой (содержание пептидогликана до 90%), в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате Гр+ бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У Гр- бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

К самостоятельной работе

 

Методы выявления спирохет (трепонем, боррелий, лептоспир)

Оболочка спирохет тонкая, эластичная, содержит большое количество липопротеидов до 70 - 80% и тонкий фрагментированный слой пептидогликана. Обычными методами трепонемы не окрашиваются, так как при фиксации спиртом оболочка легко разрушается, и клетка не в состоянии удерживать красители. Спирохеты, так же как и простейшие, плохо окрашиваются анилиновыми красителями. Для их дифференцирования применяют краску Романовского-Гимзы. Лучше окрашиваются боррелии (в синий цвет), хуже лептоспиры (в розовый), еще хуже трепонемы (в слабо - розовый). Бледная трепонема покрыта мукополисахаридным чехлом, под клеточной стенкой имеется скопление протеолитических ферментов, с их помощью она способна активно внедряться в цитоплазму и даже ядро клеток организма хозяина.

Методика окраски по методу Романовского-Гимзы:

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.

1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.

2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

Методы выявления актиномицетов

По химическому составу оболочка актиномицетов близка к оболочке бактерий, поэтому они окрашиваются анилиновыми красителями. Обычно их окрашивают простыми методами, по Граму или Цилю-Нильсену. Актиномицеты являются грамположительными микроорганизмами.

С помощью прокаленного и остуженного скальпеля отрезают небольшой кусочек культуры актиномицета на плотной питательной среде и помещают его в каплю воды на предметном стекле. Каплю накрывают вторым чистым предметным стеклом. Стекла плотно придавливают друг к другу, растягивают и таким образом получают два мазка, которые высушивают, фиксируют обычным способом и окрашивают водным фуксином.

При микроскопии видно сплетение тонких нитей, истинное ветвление их и большое количество свободно лежащих экзоспор - конидий. В гистологическом срезе из органа при актиномикозе центральная часть друзы актиномицета представляет сплетение тонких нитей, окрашенных в темно-фиолетовый цвет. Отходящие на периферию концевые нити образуют колбовидные вздутия, окрашенные в розовый цвет

Окраска по Цилю-Нильсену

Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов (микобактерий, актиномицет). Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов, воска и оксикислот. Принцип основан на том, что кислотоустойчивые бактерии, за счет содержания указанных веществ, прочно связывают карболовый фуксин при нагревании (т.е. окрашиваются в красный цвет) и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются серной кислотой и при использовании дополнительного красителя – метиленового синего – окрашиваются в синий свет.

Методика окраски по методу Циля - Нильсена:

1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.

2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

3. Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин до обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.

12	Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: