 |
Методы выявления ф. верул-сти(ф.агрессии:лизоцима, гиалуронидаза, лецитоветиллазы)
|
|
|
|
Тест на гиалуронидазу. Гиалуронидаза — фермент, расщепляющий гиалуроновую кислоту и, как следствие, деполимеризующий межклеточное вещество. Рассматривают как фактор инвазивности бактерий
На поверхность агара в чашке Петри дробно засевают культуру P. multocida или S. equi. Затем в виде линии высевают на поверхность среды культуру микроорганизма, у которого выявляют способность к синтезу гиалуронидазы. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С 16...24 ч. Если исследуемый микроорганизм выделяет гиалуронидазу, то она диффундирует в толщу питательной среды и разрушает капсулу тест-микроба. При анализе посевов в косопроходящем пучке света колонии S. equi (P. multocida) вблизи «штриха» исследуемой культуры меньше по размеру, серого или голубого цвета в отличие от флуоресцирующих отдаленных колоний.
Тест на лецитиназу. Лецитиназа расщепляет гидролизом лецитин. Готовят желточный агар: пептон — 20 г, гидрофосфат натрия — 2,5 г, натрий — 1 г, 0,5%-й раствор сульфата магния — 0,1 мл, глюкоза—1 г, агар—12,5 г, вода дистиллированная — 500 мл. Устанавливают рН 7,2...7,4, стерилизуют при 121 °С 15 мин, охлаждают до 55 ºС, добавляют один стерильный желток на 500 мл среды, компоненты перемешивают и смесь разливают в чашки Петри.
Исследуемую культуру засевают дробно на желточный агар, культивируют при 37...38 °С 24...48 ч. Положительный результат — появление зоны помутнения вокруг колоний.
Методы определения персистентных свойств бактерий
Антилизоцимный фактор, направлен на инактивацию лизоцима и обеспечивает выживание возбудителя в макрофагах.
Антикомплементарный признак обеспечивает персистирование микробной клетки и характеризует способность инактивировать бактериальными клетками системы комплемента макроорганизма.
|
|
|
РА на стекле
Реакция агглютинации на предметном стекле используется для ускоренной постановки диагноза (идентификации аозбу-дитепя). Для этого на предметном стекле пастеровской пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки и рядом на том же стекле помещают каплю физиологического раствора для контроля. Петлёй снимают небольшое количество исследуемого материала бактерий (можно брать бактерии из колоний на чашке, со скошенного агара) и вносят их в каплю сыворотки; размешивают до получения равномерной мути. Второй же комочек микробной массы размешивают в капле физиологического раствора. Через несколько минут при положительной реакции агглютинации в капле с сывороткой появляются хлопья, видимые на глаз на темном фоне, тогда как контрольная капля остаётся равномерно мутной. Мы работаем с брюшнотифозными сыворотками и соответствующими культурами.
Реакция широко применяется для серологической идентификации
выделенных микробов, а также при постановке ускоренных серологических
реакций.
Постановка реакции:
Пастеровской пипеткой наносят на предметное стекло каплю сыворотки в
нужных разведениях. В каждую каплю сыворотки вносят петлю 24-часовой
агаровой живой культуры или каплю диагностикума. Постановка реакции
должна сопровождаться контролем антигена и контролем сыворотки. Учет
реакции производят через 5-10 минут.
Компоненты:
1. Антигены неизвестного вида;
2. Известная иммунная сыворотка;
3. Физиологический раствор.
РА Вейгля
Вейгля реакция — макроскопическая реакция агглютинации, применявшаяся ранее для диагностики сыпного тифа. Обнаруживается на 4—6-й день заболевания и достигает максимума ко времени падения температуры, причем высота титров соответствует тяжести заболевания. К сыворотке больных добавляют антиген, выделенный из риккетсий Провацека, культивированных в кишечнике зараженных вшей. Реакция Вейгля положительна при темном осадке на дне пробирки с прозрачной жидкостью над ним; при отрицательной реакции Вейгля жидкость остается мутной. В настоящее время реакция Вейгля не применяется.
|
|
|
РА Райта
Реакция агглютинации является одним из основных методов диагностики бруцеллеза у людей. Наибольшую диагностическую ценность реакция агглютинации представляет при острой и подострой форме бруцеллеза.
Техника постановки реакции.
В пробирки разливают физиологический раствор: в первую - 2,4 мл, в остальные по 0,5 мл. В первую пробирку добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки, перемешивают, переносят 0,5 мл в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл смеси выливают, в результате получают в каждой пробирке по 0,5 мл следующих разведений 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. Из первой пробирки 0,5 мл переносят в чистую пробирку и добавляют туда 0,5 мл физиологического раствора (контроль сыворотки в разведении 1:50), а 1,0 мл выливают.
Диагностикум разводят физиологическим раствором согласно прилагаемому к нему наставлению и добавляют по 0,5 мл во все пробирки, кроме контроля. После добавления диагностикума разведение сыворотки соответственно удваивается, т.е. получается 1:50, 1:100 и т.д. Сыворотки с антигеном смешивают путем встряхивания и помещают в термостат (37 °C) на 18 - 20 часов. После инкубации пробирки выдерживают 1 - 2 часа при комнатнойтемпературе и проводят учет реакции.
Учет реакции проводят по стандарту мутности в зависимости от степени осаждения агглютината и просветления жидкости.
Для приготовления стандарта мутности антиген, применяемый для постановки РА, еще раз разводят в два раза.
Дальнейшее разведение антигена физиологическим раствором производят по схеме 1.
РАЗВЕДЕНИЕ АНТИГЕНА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИМ РАСТВОРОМ
| Степень агглютинации | |||||
| ++++ | +++ | ++ | + | ||
| Антиген, разведенный 1:2 | 0,25 | 0,5 | 0,75 | 1,0 | |
| Физ. раствор | 1,0 | 0,75 | 0,5 | 0,25 | |
| % просветления |
Стандарт мутности готовят каждый раз при постановке РА и ставят в термостат одновременно с основной реакцией.
Титром сыворотки является максимальное ее разведение, дающее 50% агглютинации, - просветление, оцениваемое на 2+.
|
|
|
При применении стандартизированного диагностикума титры исследуемых сывороток соответствуют количеству международных единиц антител (ме/мл).
Так, титры 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. соответственно равны 50, 100, 200 и т.д. ме/мл.
При диагностической оценке РА рекомендуется следующая схема:
- титр сыворотки 1:100 (100 ме/мл) - результат положительный;
- титр сыворотки 1:200 (200 ме/мл) - результат положительный;
- титр сыворотки 1:400 (400 ме/мл) - результат резко положительный.
Диагностическим титром принято считать реакцию агглютинации не менее 2+ при разведении сыворотки 1:100 и выше.
Недостатком реакции агглютинации признают также необходимость частых кровопусканий у животных, что создаёт почти непреодолимые трудности при реализации этого метода в крупных хозяйствах, в особенности У овец и свиней. У последних неудобство усугубляется тем, что изъятие крови производят из хвоста.
РА Видаля
Реакция агглютинации широко применяется в лабораторной практике для серодиагностики. Реакция агглютинации протекает в две фазы:
1 фаза - соединение антигена с антителом;
2 фаза - адсорбция на комплексе антиген+антителофизиологического
раствора и выпадение осадка двух видов:
а) крупнохлопчатого - у жгутиковых бактерий (Н-агглютинация);
б) мелкозернистого - агглютинат образуется в виде компактных зерен
(О-агглютинация).
Компоненты реакции Видаля:
1) испытуемая сыворотка в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800,
1:1600;
2) диагностикумы - взвесь убитых сальмонелл трех видов: брюшного
тифа, паратифа А и В;
3) физиологический раствор.
Цель реакции: определение титра антител в испытуемой сыворотке.
Реакция агглютинации должна сопровождаться контролем антигена и сыворотки. Реакция ставится в трех рядах. Учет результатов проводят через 18-20 часов.
Степень положительной реакции агглютинации обозначается плюсами: + + + + полная агглютинация + + + неполная агглютинация + + слабая агглютинация - осадка нет (отрицательная реакция) б) реакция Вейгля
|
|
|
Ставится с 8 дня болезни при сыпном тифе и болезни Брилля-Цинссера для обнаружения антител в испытуемой сыворотке крови. Компоненты реакции Вейгля:
1) испытуемая сыворотка в разведениях 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800;
2) риккетсиозныйдиагностикум - взвесь убитых риккетсий Провачека
3) физиологический раствор
Реакция применяется при рецидивах эпидемического сыпного тифа (болезни Брилля-Цинссера), обусловленных реактивацией риккетсий Провачека в сыпнотифозных гранулемах.
Специфические антитела (агглютинины) обнаруживаются в крови больного со 2-ой недели болезни. Для постановки реакции Видаля берут шприцем кровь из локтевой вены в количестве 2-3 мл и дают ей свернуться. Образовавшийся сгусток отделяют, а сыворотку отсасывают в чистую пробирку и готовят из неё 3 ряда разведений сыворотки больного от 1:100 до 1:800 следующим образом: во все пробирки разливают по 1 мл (20 капель) физиологического раствора; затем этой же пипеткой наливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:50 в первую пробирку, перемешивают с физиологическим раствором, таким образом получают разведение 1:100, Из этой пробирки переносят 1 мл сыворотки в следующую пробирку, перемешивают с физиологическим раствором, получают разведение 1:200 также получают разведения 1:400 и 1:800 в каждом из трёх рядов. Реакция агглютинации Видзля ведётся в объеме 1 мл жидкости, поэтому из последней пробирки после смешения жидкости удаляют 1 мл. В отдельную контрольную пробирку наливают 1 мл физиологического раствора без сыворотки. Этот контроль ставится для проверки возможности спонтанной агглютинации антигена (диагностикума) а каждом ряду {контроль антигена). Во все пробирки каждого ряда, соответствующего надписям, закапывают по 2 капли диагностикума. Штатив ставят в термостат на 2 часа при 37 «С и затем на сутки оставляют при комнатной температуре. Учёт реакции производится на следующем занятии.
В сыворотках больных могут быть как специфические, так и групповые антитела, которые различаются по высоте титра. Специфическая реакция агглютинации идёт обычно до более высокого титра. Реакция считается положительной, если агглютинация произошла хотя бы в первой пробирке с разведением 1:200. Обычно она наступает в больших разведениях. Если наблюдается групповая агглютинация с двумя или тремя антигенами, то возбудителем болезни считают того микроба, с которым произошла агглютинация в наиболее высоком разведении сыворотки.
Недостатки реакции:
1. реакция положительна, начиная со 2-ой недели заболевания;
2. реакция положительна в 3-х случаях: у больных (инфекционная реакция), у переболевших (анамнестическая) и у вакцинированных (прививочная).
|
|
|
Для дифференциации реакций прибегают к повторной постановке ее через 5-6 дней. У больных отличается резкое нарастание титра антител При прививочной и анамнестической реакциях титр антител не изменится.
Реакцию Видаля можно поставить одновременно с Н- и О-антигенами бактерий брюшного тифа, что помогает дифференцировать инфекционную реакцию от прививочной, так как у привитых обнаруживаются только Н-антитела, О-агглютинин в высоком титре отмечается только в разгар болезни.
РПГА(п/дифтирийный)
Антитоксический противодифтерийный иммунитет проверяют с помощью РПГА с дифтерийным эритроцитарным диагностикумом (анатоксином).
Неимунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мг
Ингредиенты:
1. Испытуемая сыворотка, адсорбированная бараньими эритроцитами;
2. Эритроцтарный диагностикум;
3. Физиологический раствор;
4. Противодифтерийная контрольная сыворотка активностью 10 ME.
Постановка реакции:
1) Сыворотку разводят физиологическим раствором в 12 лунках от
1:10 до 1:20480(1:40-1:5120)
2) В каждую лунку добавляют по 1 капле диагностикума;
3) Противодифтерийную контрольную сыворотку разводят также от
1:10 до 1:20480 и вносят по 1 капле диагностикума;
4) Оставляют на 3 часа при комнатной температуре.
РПГА(п/скарлатинозный)
РА по Асколи
Реакция Асколи ставится для диагностики сибирской язвы с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь: преципитиноген — гаптен B. Antrachis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая сибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.
Приготовление термопреципитиногена.
1. 8 колбочку, содержащую 1 г измельчённой кожи или 1 мл культуры В. ап1Ьгас!3, налить 10 мл физиологического раствора.
2. Колбу поместить в кипящую баню на 30-45 минут.
3. Просрильтровать через асбестнуюэату. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен.
Для реакции преципитации фильтрат разводится в 100 раз и более.
Постановка реакции кольцепреципитации.
1) В преципитэционную пробирку наливается 0,3 мл пре-ципитирующей сыворотки цельной или в разведении 1:5, 1:10.
2) По стенке пробирки осторожно наслаивается преципи-тиноген-
Реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо выпадающего белка не позднее 5-15 минут.
При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:
а) антиген и физиологический раствор;
б) специфическая сыворотка и физ. раствор;
в) антиген и неспецифическая сыворотка.
Во всех контрольных пробирках помутнения не должно быть Для реакции преципитации пользуются специальными преципитационными пробирками высотой 40-60 мм и диаметром 4-5 мм, преципитация в узких пробирках наступает значительно скорее и проявляется более чётко, чем в обычных пробирках, их тщательно моют и высушивают, чтобы стекло их было совершенно прозрачным и сухим.
|
|
|
