 |
Поглощение антибиотиков клетками микробов
|
|
|
|
Первый этап во взаимодействии микроорганизмов с антибиотиками — адсорбция его клетками. Пасынский и Косторская (1947) впервые установили, что одна клетка Staphylococcus aureus поглощает примерно 1 000 молекул пенициллина. В последующих исследованиях эти расчеты были подтверждены. Так, по данным Мааса и Джонсона (1949), приблизительно 10 – 9 М пенициллина поглощается 1 мл стафилококков, причем около 750 молекул этого антибиотика необратимо связываются одной клеткой микроорганизма без видимого эффекта на ее рост.
Игл с сотрудниками (1955) определил, что при связывании бактериальной клеткой 1 200 молекул пенициллина угнетения роста бактерий не наблюдается. Угнетение роста микроорганизма на 90 % наблюдается в тех случаях, когда клеткой будет связано от 1 500 до 1 700 молекул пенициллина, а при поглощении до 2 400 молекул на клетку происходит быстрая гибель культуры.
Установлено, что процесс адсорбции пенициллина не зависит от концентрации антибиотика в среде. При низких концентрациях препарата (порядка 0,03 мкг/мл) он может весь адсорбироваться клетками, и дальнейшее повышение концентрации вещества не поведет к повышению количества связанного антибиотика.
Имеются данные (Купер, 1954) о том, что фенол препятствует поглощению пенициллина клетками бактерий, однако он не обладает способностью освобождать клетки от антибиотика.
Пенициллин, стрептомицин, грамицидин С, эритрин и другие антибиотики связываются различными бактериями в заметных количествах. Причем антибиотики-полипептиды адсорбируются микробными клетками в большей степени, чем, например, пенициллины и стрептомицин.
Булгакова и Полин (1966) установили, что грамицидин С адсорбируется как чувствительными, так и устойчивыми к нему бактериями. Причем адсорбция этого антибиотического вещества бактериями происходит сразу же после внесения антибиотика в суспензию клеток и достигает значительных величин (до 500 мкг/мг сухой биомассы).
|
|
|
В присутствии положительно заряженных ионов (Na +, K +, NH +, Mg 2+), а также при рН среды, равном 4, поглощение грамицидина С бактериальными клетками заметно снижается.
Адсорбированный чувствительными клетками грамицидин С прочно связывается с бактериями и снимается с них лишь при длительной экстракции подкисленной спиртово-водной смесью.
У устойчивого к антибиотику штамма E. coli при промывании клеток раствором NaCl удается удалить лишь до 30 % адсорбированного грамицидина С.
Ванкомицин, образуемый Actinomyces orientalis, необратимо и относительно быстро связывается клетками бактерий, чувствительными к нему. По данным Reunolds (1966), при концентрации антибиотика в среде, равной 30 мкг/мг массы сухих бактерий, около 90 % ванкомицина связывается с бактериями. Показано, что максимальное связывание ванкомицина бактериальными клетками достигает величин 10 7 молекул антибиотика на клетку.
Связанные клеткой антибиотики могут проявлять двоякого рода действия: содной стороны, некоторые из них могут действовать как поверхностно-активные вещества, а с другой стороны, антибиотики, проникая вглубь клетки, нарушают отдельные стороны метаболизма организма.
Гибель клеток под воздействием поверхностно-активных антибиотиков может быть связана с нарушением механизма осмотического равновесия, имеющего место на поверхности микробной клетки; она может также наступить в результате способности этих веществ, скапливающихся у поверхности раздела жидкая фаза — микробная клетка, связываться с компонентами клеток.
Экспериментальные данные в этом отношении показали, что изменения в регулировании осмотического давления сопровождаются разрушением систем клеточной стенки микроба. Нарушение проницаемости клеточной стенки является или результатом прямого вливания антибиотических веществ, или же может быть результатом вторичных процессов.
|
|
|
Действие антибиотиков как поверхностно-активных веществ может вызывать диссоциацию белка с отделением от него простетических групп или нуклеиновых кислот. Эти вещества могут также приводить к денатурации белков и, таким образом, непосредственно влиять на энзиматические системы, связанные с клеточной стенки (инвертазы, фосфатазы, различные дегидрогеназы, цитохромные системы).
Таким образом, если антибиотик обладает способностью нарушать системы, регулирующие осмотические свойства клеточной стенки, иными словами, если антибиотик выступает в качестве поверхностно-активного соединения, то он может оказывать бактерицидное действие.
К числу антибиотических веществ, механизм действия которых связан с поверхностно-активными свойствами, следует отнести грамицидин С, тироцидин, полимиксины, а также тетрациклины, если последние применяются в концентрациях, во много раз превышающие бактериостатические.
Вместе с тем, как уже отмечалось выше, антибиотики, попадая в микробную клетку, могут нарушать отдельные этапы метаболизма организма, подавлять некоторые звенья в цепи биохимических процессов.
Подавление отдельных звеньев в биохимической цепи превращений может происходить как путем необратимого связывания антибиотиком одного из компонентов реакции, так и в результате конкурентного подавления биологически важных метаболитов клетки.
Если в организме или в среде одновременно присутствуют два вещества — обычный для организма субстрат S и ингибитор I, сходный по структуре с субстратом и оба они могут вступать в связь с энзимом (Е), как показано в уравнениях (1 и 2):
S+E SE (1)
I+E IE (2), то мы имеем типичный пример конкурентного подавления или конкурентного обмена.
В качестве примера конкурентного обмена можно привести участие сульфаниламина как антиметаболита n-аминобензойной кислоты в витамине фолиевой кислоты.
Как только сульфаниламид, в случае его присутствии в клетке, включается в фолиевую кислоту вместо ПАБК, ферментативные функции бактериальной клетки блокируются. Это в свою очередь приводит к нарушению механизма обмена веществ клетки и, вслед за этим, к ее гибели.
|
|
|
В качестве примера конкурентного действия антибиотика при биосинтезе белка можно назвать пуромицин. Этот антибиотик образуется культурой Act. alboniger.
Анализ химической структуры пуромицина показал, что он представляет собой структурный аналог 3-конечной аминоацилированной группировки тРНК.
Суммирование имеющихся данных по механизму биологического действия пуромицина дает возможность заключить, что оно выступает в качестве конкурентного аналога аминоацил-тРНК, заменяя последнюю в реакции с пептидил-тРНК, что приводит к освобождению пептидила в виде пептидил-пуромицина из рибосомы и, таким образом, прекращая синтез белка (Спирин, Гаврилова, 1971).
Есть указания на то, что окситетрациклин выступает в качестве конкурентного ингибитора дифосфопиридиннуклеотида при действии его на E. coli.
Установлено, что актитиазовая кислота (антибиотик актиномицетного происхождения) — конкурент витамина биотина, сходного по строению с кислотой. Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что явление конкурентного ингибирования не имеет широкого распространения в механизме действия антибиотических веществ.
Существует гипотеза, впервые высказанная Ч. Кэвеллито, что биологическая активность многих антибиотиков (бензилпенициллина, стрептомицина, аллицина, пиоцианина и др.) обусловлена тем, что они вступают в связь с сульфгидрильными группами (-SH) ферментов, превращая их в неактивные вещества, но такая точка зрения на механизм действия антибиотиков не была строго обоснованной.
Однако появились указания (Gross, Morell, 1967) на то, что механизм биологического действия антибиотика низина связан с взаимодействием его с сульфгидрильными группами метаболитически важных ферментов (глютатин, ацетилкоэнзим А).
Симбиотические связи бактерий с бобовыми благодаря широкому использованию их в полевом растениеводстве, луговодстве и, частично, в лесоводстве, изучались весьма интенсивно. Установлено, что не все виды бобовых имеют на корнях клубеньки. При обобщении имеющихся данных, оказалось, что из 1285 изученных бобовых (в широком понимании этой группы) клубеньки отсутствовали у 166 (13,0 %), в том числе у 77,4 % изученных цезальпиновых, у 13 % мимозовых и 7 % мотыльковых (Fabaceae) (E. Allen, O. Allen, 1961).
|
|
|
Отсутствие клубеньков на корнях не всегда означает неспособность данного вида бобовых к симбиозу с клубеньковыми бактериями, иногда это происходит из-за местных условий, неблагоприятных для образований клубеньков, или по тому, что в почве нет соответствующих рас клубеньковых бактерий. В то же время наличие клубеньков на корнях бобовых не всегда указывает на активную фиксацию азота клубеньковыми бактериями. Установлено, что многочисленные мелкие белые клубеньки на боковых корнях травянистых бобовых образованы малоэффективной расой клубеньковых бактерий, неспособной связывать атмосферный азот или фиксирующий его в незначительном количестве, в то время как крупные, окрашенные в розовый цвет клубеньки на стержневом корне обычно характеризуют энергично идущий процесс усвоения азота.
А процесс естественного отбора и сопряженной эволюции возникло много рас клубеньковых бактерий, способных выступать в эффективные симбиотические отношения с определенными видами бобовых. Значение отдельных рас клубеньковых бактерий давно было выяснено для возделываемых видов бобовых, и, в связи с необходимостью в ряде случаев вносить бактериальное удобрение (нитраты), содержащие соответствующие клубеньковые бактерии, они были разделены на ряд групп в соответствии с пригодностью для определенных видов бобовых. Принято выделять следующие расы клубеньковых бактерий по их способности к эффективному симбиозу со следующими определенными видами или группами видов бобовых:
· горох, вика, кормовые бобы;
· фасоль;
· соя;
· люпин, сераделла;
· вигна, магу, арахис;
· нуж;
· клевер;
· люцерна, донник, пажитник;
· эспарцет;
· лядвенец (Вознесенская, 1969).
На самом деле число рас клубеньковых бактерий значительно больше.
Выявлена специфичность рас клубеньковых бактерий в пределах уже установленных групп, в частности в "клеверной группе", например у клевера несходного, клубеньки возникают лишь при участии особой расы клубеньковых бактерий.
Эта специфичность проявляется также в значительных различиях фиксируемого ими азота в зависимости от вида клевера, с которым они связаны. В таблице 12 показано, что наиболее эффективные для клеверов лугового и ползучего расы клубеньковых бактерий для клевера подземного были наименее эффективными, и наоборот. Расы, обеспечивающие фиксацию очень значительных количеств азота при инокуляции ими клевера подземного, в симбиозе с клевером луговым и ползучим фиксировали незначительное количество азота. Все это обусловило выделение среди "клеверной группы" трех подгрупп: А — клевера ползучий, луговой, розовый, простертый, земляничный; В — подземный, инкармантный, скученный, александрийский; С — несходный. Три подгруппы выделяют и среди "люцерновой группы".
|
|
|
Способность отдельных рас клубеньковых бактерий фиксировать атмосферный азот при симбиозе с различными видами клевера (содержание азота в мг на 8 растений; по White et al., 1953)
| Виды клевера | Расы бактерий | |||
| № 1 | № 16 | № 8 | № 13 | |
| Клевер луговой Клевер ползучий Клевер подземный | 51,4 59,6 7,9 | 34,3 46,5 7,2 | 2,8 10,5 138,5 | 1,9 7,0 153,5 |
Возможность фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями и количество фиксированного азота определяются также средой — отсутствием условий, ограничивающих жизнедеятельность бактерий и бобовых растений (высокая кислотность, высокое содержание растворимого алюминия, плохая аэрация и др.), а также достаточной обеспеченностью фосфором, калием, кальцием, молибденом, серой, кобальтом, водой и др.
Фиксация азота клубеньковыми бактериями снижается по мере увеличения содержания в почве растворимых форм азота, доступных для бобовых. Большое значение имеют условия освещения, поскольку клубеньковые бактерии получают от бобового углеводы, необходимые им как энергетический материал для фиксации азота, и потому зависят от фотосинтеза. При затенении резко снижается не только число клубеньков, но и их размеры, а также предельная глубина их образования.
Клубеньковые бактерии более экономно используют энергию, необходимую для фиксации азота, затрагивая 3 – 4 г углеводов на 1 г азота, в то время как свободноживущие азотфиксирующие бактерии затрачивают 50 – 100 и более граммов на фиксацию 1 г азота. Это связано с тем, что у свободноживущих азотфиксаторов фиксация азота происходит в процессе их роста, и потому большое количество энергии потребляется на этот рост. Кроме того, в целях создания благоприятных условий для активности нитрогеназы — фермента, участвующего в фиксации азота, для снижения парциального давления кислорода усиливается дыхание, что связано с затратой энергии. Эти расходы энергии отсутствуют у клубеньковых бактерий. Поскольку фиксация азота происходит в бактероидах, клетках, прекративших рост, а внутри клубеньков создаются благоприятные условия для активности нитрогеназы. В том числе сниженное содержание кислорода. Очень существенно то, что фиксируемый клубеньковыми бактериями азот на 90 – 95 % передается бобовым растениям. Бобовые, получая связанный азот от клубеньковых бактерий, не зависят или мало зависят от обеспечения минеральным азотом почвы и потому могут успешно произрастать совместно с другими растениями на почвах, бедных доступными формами азота.
Количество азота, фиксируемого клубеньковыми бактериями бобовых, сильно варьирует от фитоценоза к фитоценозу, а в пределах конкретных фитоценозов может изменяться от года к году. Оно определяется участием бобовых в фитоценозах, условиями среды и эффективностью соответствующих рас бактерий. Для некоторых лугов в Новой Зеландии с травостоями, где преобладает клевер, отмечена фиксация азотом до 450 – 550 кг/га.
Фиксация азота в столь больших количествах возможна лишь в условиях исключительно благоприятного климата Новой Зеландии (равномерное распределение большого количества атмосферных осадков, отсутствие засух, благоприятные тепловые условия, возможность вегетации в течение всего года), когда растения в результате применения известкования и внесения удобрений произрастают в условиях благоприятных для них реакций почвы и обеспечены необходимыми зольными элементами. Однако, даже в Новой Зеландии среднее количество азота, фиксируемого клубеньковыми бактериями бобовых, входящих в состав луговых травостоев, составляло 185 кг/га (колебания достигали 85 – 340 кг/га от луга к лугу и в среднем от года к году 145 – 225 кг/га). В годы с более влажным и прохладным летом оно было выше, а в годы с сухим, более теплым летом - ниже. Данные о сходных количествах фиксируемого азота клубеньковыми бактериями бобовых получены для Ирландии (в среднем 160 кг/га) и Южной Англии (250 – 270 кг/га) и относятся к лугам, созданным путем посева трав. На природных лугах нашей страны, в травостоях которых бобовые принимают меньшее участие, количество азота, фиксируемого клубеньковыми бактериями, как правило, не более 30 – 50 кг/га. В посевах многолетних трав (бобовых или бобовых в смеси со злаками) количество фиксируемого азота обычно не превышает 200 кг/га.
Давно замечено, что бобовые благоприятно влияют на произрастающие совместно с ними злаки и другие растения, в том числе увеличивают содержание азота в их органах. На основе результатов вегетационных опытов Виртанен пришел к выводу, что такое воздействие связано с прижизненными выделениями из корней бобовых в почву значительных количеств азотсодержащих соединений. Проверка результатов опытов Виртанена, проведенная в СССР, Шотландии, США, Австралии, не подтвердила его выводов. Оказалось, что в условиях нормального фотосинтеза бобовые не выделяют в почву сколь-либо заметных количеств азотистых соединений. Лишь с ослаблением фотосинтеза (при сниженной интенсивности освещения), когда растения не располагают достаточным количеством углеводов и органических кислот для связывания всего фиксируемого клубеньковыми бактериями азота, часть его может выделяться в почву. Благоприятное влияние бобовых на другие растения можно объяснить поступлением в почву азота с их отмирающими органами, у древесных растений — в основном с опадом, у травянистых (в фитоценозах, используемых как сенокосы и пастбища) — преимущественно с отмирающими подземными органами. На пастбищах злаки получают азот бобовых из экскрементов скота, поедающих их. Так как бобовые, если фиксация азота клубеньковыми бактериями идет достаточно активно, не поглощают из почвы азот или поглощают его в незначительных количествах, на долю небобовых растений остается больше доступных форм азота, и потому они растут лучше с бобовыми, чем в их отсутствие. Совместное произрастание бобовых с небобовыми растениями оказывает благоприятное влияние на фиксацию азота клубеньковыми бактериями, так как в результате поглощения небобовыми азота из почвы содержание его доступных форм снижается до незначительных величин, что стимулирует фиксацию азота.
|
|
|
