Выделение ДНК. Химический синтез ДНК.

ДНК может быть выделена из любого биологического материала: из крови и других жидкостей организма, различных типов тканей и клеток, содержащих ядра. У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови. Процесс выделения ДНК состоит из нескольких этапов: быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение и экстрагирование белков, осаждение молекул ДНК в этаноле с последующим их растворением в буферном растворе. Оценку качества выделенной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(260)/А(280) > 1,8; где А(260) и А(280) — оптическая плотность раствора при длине волны 260 и 280 нм, соответственно.

Для научных исследований ДНК не только вьщеляют из биологического материала.но и получают синтетически при использовании ДНК-синтезаторов - приборов для автоматического синтеза ДНК. Принципиальное отличие процесса химического синтеза от биологического состоит в присоединении каждого нового нуклеотида к 5'-гидроксильному концу цепи, а не к З'-концу.

Наиболее распространенным методом химического синтеза ДНК является фосфорамидитный (фосфиттриэфирный) метод. Для синтеза используют модифицированныедезоксирибонуклеозиды. Для предотвращения неспецифического взаимодействия 5'-гидроксильной группы первого нуклеотида до добавления в реакционную смесь второго нуклеотида ее защищают с помощью диметокситритильной (ДМТ) группы. Каждый последующий присоединяемый к растущей цепи нуклеотид добавляется в колонку в виде фосфорамидита, т.е. содержит ДМТ-группу и диизопропиламинную группу на З'-фосфитной группе, защищенную метильным остатком. Химический синтез необходим для получения одноцепочечныхолигонуклеотидов длиной < 50 п.н. Такие олигоиуклеотиды используют для конструирования целых геномов и их фрагментов, в качестве праймеров для амплификации специфических последовательностей и секвенировании ДНК, для сайт-специфического мутагенеза invitro, в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. Химический синтез применяют при затруднении клонирования гена (если известна аминокислотная последовательность белка). В тех случаях, когда ко-доны гена плохо считываются организмом хозяина, можно синтезировать ген с таким набором кодонов (оптимизация кодонов), который сохраняет аминокислотную последовательность прежней, но транскрибируется более эффективно.

Для того чтобы синтезировать ген, необходимо каждую из цепей составляющей его последовательности синтезировать отдельно. При большой протяженности гена его синтезируют отдельными фрагментами, которые впоследствии «собирают» с помощью ДНК-полимеразы иДНК-лигазы.

Все молекулярно-генетические методы основаны на использовании различных классов ферментов, два из которых имеют наибольшее значение: ДНК-полимеразы и рестриктазы.

ДНК-полимеразы осуществляют синтез ДНК, и для их работы необходима одноцепочечная матричная ДНК с двухцепочечным участком на 3'-конце молекулы и четыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP: dATP, dCTP, dGTP и dTTP). ДНК-полимеразы обладают различными видами активности, в том числе и экзонуклеазной в направлении 3' -» 5', что позволяет этим ферментам репарировать дефекты, образовавшиеся при синтезе ДНК. Способность ДНК-полимеразы I E. colt инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом никтрансляции, а также для заполнения брешей при сборке протяженного гена из химически синтезированных олигонуклеотидных последовательностей. Основное свойство ДНК-полимераз- осуществлять синтез ДНК — используют при амплификации изучаемого фрагмента ДНК. Одним из видов амплификации является полимеразная цепная реакция.

Методы секвенирования ДНК

Геном человека состоит из трех миллиардов пар нуклеотидов. Каждый нуклеотид содержит одно из четырех азотистых оснований – А, С, G или Т, составляющих тот алфавит, с помощью которого записывается генетическая информация в молекуле ДНК. Основания одной цепи ДНК спариваются с основаниями другой цепи по строго определенным правилам (А образует пару с Т, G – с С), поэтому достаточно определить последовательность оснований в одной из них.

Чтобы идентифицировать конкретное основание в какой-то области генома, необходим сенсор, способный заметить субнанометровое различие между А, Т, G и С. Единственный физический метод, обладающий столь высокой разрешающей способностью, – сканирующая туннельная спектроскопия. Однако при секвенировании последовательностей длиной в миллиарды звеньев чаще всего используются не физические, а химические способы.Геном человека был расшифрован с помощью методики, разработанной в конце 1970-х гг. американским биохимиком Фредериком Сангером. При этом процедуре секвенирования предшествует разрезание исследуемой молекулы ДНК на фрагменты, клонирование их в E. сoli и многократная дупликация для получения миллионов копий каждого фрагмента. В результате последнего раунда дупликации, проводимого в особых условиях, получают набор копий фрагментов разной длины, каждый из которых заканчивается флуоресцентно меченым нуклеотидом. Фрагменты разделяют по длине с помощью электрофореза, регистрируют световой сигнал от каждого из них по мере прохождения через детектор и получают нуклеотидную последовательность исходной цепи.

К достоинствам метода Сангера относятся его относительная простота и высокая точность, но, несмотря на последующие усовершенствования, он остается дорогим и трудоемким. Задача создателей альтернативных путей секвенирования состояла в повышении скорости процедуры и ее удешевлении. Для этого нужно было исключить этапы разделения, занимающие много времени, миниатюризировать всю систему, сохранив при этом возможность прочитывать последовательности миллионов фрагментов.

Многие исследовательские группы положили в основу своих разработок биосинтез – процесс, который используют живые организмы при воспроизведении своего генома и устранении в нем повреждений. Так, в клетке, готовящейся к делению, двойная спираль ДНК расплетается, составляющие ее цепи расходятся, а затем на каждой из них синтезируется новая цепь (на одной – непрерывно, на другой – прерывисто, с образованием отдельных фрагментов). Процесс последовательного присоединения нуклеотидов к растущей цепи катализируется особым ферментом ДНК-полимеразой. Другой фермент, лигаза, сшивает фрагменты. В результате образуются две новые полноразмерные полинуклеотидные цепи, комплементарные тем ДНК-матрицам, на которых они синтезировались.

Методы секвенирования при помощи биосинтеза берут за основу те стадии упомянутого процесса, которые протекают на одиночной цепи секвенируемой ДНК. Регистрируется момент присоединения к праймеру, гибридизовавшемуся с ДНК-матрицей, комплементарного нуклеотида (удлинение цепи), или момент сшивания лигазойпраймера с олигонуклеотидным зондом, содержащего известный нуклеотид в определенной позиции.

Существуют разные способы регистрации данных процессов, но обычно используется один из двух типов сигналов. Если меткой служит присоединенный к нуклеотиду флуорофор, то регистрируется испускаемый им свет определенной длины волны. Флуоресцентное детектирование применяют при секвенировании как методом удлинения цепи, так и методом лигирования. Его используют многие исследователи, среди которых – Майкл Мецкер (MichaelMetzker) из Университета Бэйлора, Роби Митра (RobiMitra) из Вашингтонского университета, а также возглавляемая мною лаборатория в Гарвардской медицинской школе и в корпорации AgencourtBioscience.

Другой подход основан на регистрации биолюминесценции, которая инициируется связыванием с белком люциферазой (его синтезируют хорошо знакомые нам светлячки) пирофосфата, высвобождаемого после присоединения к праймеру очередного нуклеотида. Он создан Мустафой Ронаги (MostafaRonaghi) из Стэнфордского университета и применяется фирмами Pyrosequencing/Biotage и 454 LifeSciences.

В обоих случаях для получения достаточно сильного сигнала приходится проводить одновременно большое число реакций комплементарного спаривания и тестировать сразу множество копий целевой последовательности. Правда, предпринимаются попытки создать метод детектирования, позволяющий улавливать сигнал от одной молекулы. Над этим работают Стивен Квейк (StephenQuake) из Калифорнийского технологического института и фирмы HelicosBiosciences и Nanofluidics. Если их усилия увенчаются успехом, то существенно сократится и стоимость процедуры секвенирования, и время ее проведения.

При детектировании флуоресценции одной молекулы 5% сигналов не улавливается, и, чтобы ликвидировать возникающие в результате пробелы в последовательности, приходится проводить считывание несколько раз. По этой причине многие предпочитают вначале амплифицироватьсеквенируемую цепь ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Здесь тоже разработан целый ряд новых подходов, позволяющих обойтись без предварительного клонирования ДНК в бактериальных клетках.

Один из них – бесклеточная система амплификации, созданная Эриком Кавасимой (EricKawashima) из Института фармакологических исследований Сероно в Женеве, Александром Четвериным из Института белка РАН в г. Пущино и Роби Митрой из Гарвардского университета. Метод состоит в создании с помощью ПЦР отдельных молекулярных колоний (миллионов копий одной-единственной молекулы ДНК) прямо на предметном стекле микроскопа или на пластинке геля. Каждая такая колония (в англоязычной литературе ее называют polony, от PCR-colony) не превышает в диаметре одного микрона, и на одной подложке их помещается до нескольких миллиардов.

Молекулярные колонии можно выращивать также на крошечных бусинках, заключенных в масляной капле – своеобразной камере для проведения ПЦР. Миллионы таких бусин, покрытых копиями ДНК-матриц, фиксируют на гелевой пластине и проводят одновременноесеквенирование всех молекул.

Список методов амплификации матриц, их секвенирования и регистрации сигнала велик. Так, в основе одного из альтернативных методов лежит способность цепей ДНК спариваться (гибридизоваться) лишь с комплементарными последовательностями. Способ, впервые примененный компаниями Affymetrix, PerlegenSciences и Illumina, получил широкое распространение. Его используют прежде всего для выявления минимальных различий в нуклеотидных последовательностях уже идентифицированных генов. Для этого синтезируют короткие одноцепочечные ДНК со всеми мыслимыми последовательностями и фиксируют их на большой подложке. Затем с ними инкубируют копии матрицы, которую хотят секвенировать, и регистрируют интенсивность флуоресценции. Чем точнее соответствие между матрицей и фиксированной на подложке последовательностью, тем сильнее флуоресцения. В такой тест на специфичность гибридизации иногда включают дополнительную стадию – удлинение цепи.

Один из наиболее перспективных методов секвенирования использует для идентификации оснований в молекуле ДНК совсем другой принцип – физическое различие между четырьмя нуклеотидами, А, Т, G и С. Одноцепочечную ДНК протягивают через пору диаметром 1,5 нм, пронизывающую мембрану, и регистрируют изменение электропроводности последней по мере поочередного прохождения нуклеотидов. Каждому типу основания соответствует свое изменение электропроводности, что и позволяет прочитать нуклеотидную последовательность цепи. Метод разработан Дэном Брэнтоном (DanBranton) из Гарварда, Дейвом Димером (DaveDeamer) из Калифорнийского университета (г. Санта-Крус) и автором этой статьи Джорджем Черчем (George M.Church) и апробируется сейчас компанией AgilentTechnologics.

Альтернативный метод детектирования использует не флуоресценцию нуклеотида, а биолюминесценцию белка, возбуждаемую присоединением к нему пирофосфата, который отщепляется от dNTP в момент его включения в растущую цепь.