 |
Интерпретация хроматографических данных
|
|
|
|
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Хроматография ОФС
Взамен ст. ГФ XI
Хроматографией называется метод разделения смесей веществ, основанный на их многократном перераспределении между двумя контактирующими фазами, одна из которых неподвижна, а другая имеет постоянное направление движения. По механизму, лежащему в основе разделения, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную и другие виды хроматографии.
В настоящее время используются следующие хроматографические методы анализа, представленные на рис.1
Рисунок 1. Методы хроматографического анализа
Результат хроматографического разделения представляется в виде хроматограммы.
ХРОМАТОГРАММА И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ
Хроматограмма представляет собой графическое или иное представление сигнала детектора, концентрации веществ в элюате или другой количественной величины, используемой для измерения концентрации веществ в элюате, от времени или объема подвижной фазы. В планарной (плоскостной) хроматографии хроматограммой называют также зафиксированную на бумаге (бумажная хроматография) или ТСХ-пластинке (тонкослойная хроматография) последовательность зон адсорбции веществ исходной (анализируемой) смеси.
Схематически хроматограммы представляют собой последовательность гауссовых пиков на базовой линии (рис. 2).
Базовая линия – сигнал от подвижной фазы.
Пик – часть хроматограммы, регистрирующаяотклик детектора. Пик отображает постепенное нарастание концентрации вещества и последующее ее уменьшение. В случае линейной изотермы сорбции кривая, описывающая пик, приближается к кривой гауссова распределения.
|
|
|
Основание пика ‒ продолжение базовой линии, соединяющее начало и конец пика.
Площадь пика (S) – площадь хроматограммы, заключенная между кривой, описывающей пик, и его основанием.
Высота пика (H) – расстояние от максимума пика до его основания, измеренное параллельно оси отклика детектора.
Рисунок 2. Хроматограмма и основные хроматографические параметры
1 и 2 – пики соединений 1 и 2; t 1 и t 2 – соответствующие времена удерживания; t 0 – время удерживания несорбирующегося вещества; W 1 и W 2 – ширина пиков у основания; W 0,5 – ширина пика на половине его высоты (предполагается гауссова форма пиков)
интерпретация хроматографических данных
Время удерживания (tR или t) – время, необходимое для элюирования вещества. Соответствует времени появления максимума пика на хроматограмме.
Объем удерживания (VR) – объем подвижной фазы, необходимый для элюирования вещества. Может быть вычислен по времени удерживания и скорости потока (F).
Объем удерживания, в отличие от времени удерживания, не зависит от скорости потока.
Время удерживания несорбирующегося вещества(t0 или t м) – время, необходимое для элюирования неудерживаемого на сорбенте вещества. В эксклюзионной хроматографии t0 соответствует времени удерживания веществ, размер молекул которых больше, чем наибольшие поры сорбента.
Объем удерживания несорбирующегося вещества (V0) – объем подвижной фазы, необходимый для элюирования неудерживаемого вещества. Может быть вычислен по времени удерживания неудерживаемого вещества и скорости потока (F).
.
В эксклюзионной хроматографии V0 соответствует объему удерживания веществ, размер молекул которых больше, чем наибольшие поры сорбента.
Общее время удерживания подвижной фазы (tt) – в эксклюзионной хроматографии время удерживания веществ, молекулы которых меньше, чем наименьшие поры сорбента.
|
|
|
Общий объем удерживания подвижной фазы (Vt) – в эксклюзионной хроматографии объем удерживания веществ, молекулы которых меньше, чем наименьшие поры сорбента.
Константа (коэффициент) распределения (K0) – в эксклюзионной хроматографии характеристика элюирования вещества из определенной колонки, которую рассчитывают с помощью выражения:
.
Приведенное (исправленное) время удерживания вещества (t¢R) ‒ время удерживания вещества за вычетом времени удерживания несорбируемого вещества. Может быть рассчитано по формуле:
.
Исправленное время удерживания не зависит от объема трубопроводов хроматографической системы, установленных между инжектором и колонкой.
Относительное время удерживания (r) – относительное приведенное (исправленное) время удерживания вещества 2 по веществу 1:
.
Нескорректированное относительное время удерживания (RRT) – относительное время удерживания вещества 2 по веществу 1:
.
Если не указано иное, значения относительного времени удерживания, приведенные в фармакопейных статьях, соответствуют нескорректированному относительному времени удерживания
Коэффициент емкости (k¢) – коэффициент емкости колонки по веществу с временем удерживания tR, показывающий, во сколько раз исправленное время удерживания вещества больше, чем время удерживания несорбируемого вещества.
Эффективность хроматографической системы ‒ параметр, характеризующий степень размывания хроматографического пика. Эффективность выражается числом теоретических тарелок (N):
или
,
где: W – ширина пика у основания;
W 0,5 – ширина пика на половине высоты.
При расчете числа теоретических тарелок значения времени удерживания и ширины пика должны быть приведены к одинаковой размерности.
Число теоретических тарелок зависит от природы определяемого вещества, его концентрации или объема, вводимого в систему, от колонки, температуры колонки и состава подвижной фазы.
Если не указано иное, то эффективность хроматографической системы, требования к которой приведено в фармакопейной статье, рассчитывается по формуле, использующей ширину пика на половине его высоты.
Фактор асимметрии (фактор симметрии) пика (As) рассчитывают по формуле:
|
|
|
,
где: W 0,05 – ширина пика на 5 % (1/20) его высоты;
f – расстояние между перпендикуляром, опущенным из вершины пика, и восходящей стороной пика на 5 % его высоты (рис. 3).
Если фактор асимметрии равен 1, то пик симметричен. Если фактор асимметрии больше 1, то это означает, что растянут задний фронт пика. Если фактор асимметрии меньше 1, то пик растянут спереди.
Рисунок 3. Схема расчета фактора асимметрии пика
Разрешение (Rs)
Разрешение между пиками двух веществ смеси элюирущимися друг за другом рассчитывают по формулам:
или
,
при этом tR2 ≥ tR1. При расчете разрешения величины времени удерживания и ширины пиков должны быть приведены к одинаковой размерности.
Если не указано иное, то разрешение, требования к которому приведены в фармакопейной статье, рассчитывается по формуле, использующей ширину пиков на половине высоты.
В случае, если пики несимметричны и если интенсивность пиков значительно различается, параметр Rs не всегда корректно описывает разделение хроматографических пиков. Таким образом, даже при значениях Rs ≥ 1,5 может наблюдаться неполное разделение пиков. В этих случаях при оценке разделяющей способности можно заменить параметр Rs на параметр «отношение максимум/минимум».
Отношение максимум/минимум (p/v),называемое также отношением «peak-to-valley», «пик – долина». Этот параметр позволяет оценить разделительную способность хроматографической системы. Значение p/v рассчитывается по формуле:
,
где: Hp – высота меньшего пика относительно экстраполированной базовой линии;
H v – высота низшей точки (седловины) кривой, разделяющей пики, относительно экстраполированной базовой линии (рис. 4).
Рисунок 4. Хроматограмма не полностью разделяемых веществ
Данное соотношение применяется для оценки разделительной способности хроматографической системы, если вещества смеси разделяются не полностью. Рассчитанное отношение максимум/минимум в значительной степени зависит от выбранного варианта интегрирования хроматограммы. Результаты измерения соотношения p/v будут некорректны в случае разметкименьшего пикаметодомэкстраполяции смещенной базовой линии (методом тангенциальной касательной).
|
|
|
Отношение сигнал/шум (S/N)
Краткосрочный шум сигнала детектора (шум базовой линии) влияет на прецизионность количественного определения. Отношение сигнал/шум рассчитывают по формуле:
,
где: Н – высота пика, соответствующего рассматриваемому веществу на хроматограмме указываемого стандартного раствора, измеренная от максимума пика до экстраполированной базовой линии. Экстраполяция базовой линии проводится для сигнала на участке базовой линии во временном интервале, продолжительность которого не менее пятикратного значения ширины пика на его полувысоте;
h – размах фонового шума, измеряемый либо на хроматограмме контрольного (холостого) раствора (или раствора плацебо), либо на хроматограмме того же стандартного раствора.
Измерение размаха фонового шума проводится во временном интервале, продолжительность которого не менее пятикратного значения ширины пика на его полувысоте, расположенном, если это возможно, равномерно по обе стороны от места возможного обнаружения пика. В случае использования для измерения шума хроматограммы контрольного (холостого) раствора (или раствора плацебо) измерение размаха фонового шума проводится во временном интервале, включающем в себя время удерживания рассматриваемого вещества, при этом продолжительность временного интервала, в котором проводится измерение шума, должна не менее чем в 5 раз превышать ширину на половине высоты для пика на хроматограмме указываемого стандартного раствора (рис. 5).
Рисунок 5. Вычисление отношения сигнал/шум.
Объем задержки (D) (объем задержки градиента) представляет собой объем системы между точкой, в которой происходит смешение элюентов, и началом колонки.
Объем задержки градиента влияет на времена удерживания веществ и общий профиль наблюдаемой хроматографической картины, получаемой при использовании градиентного элюирования. Объем задержки хроматографической системы определяется следующим способом.
Колонка: заменяют хроматографическую колонку капилляром (например, 1 м × 0,12 мм).
Подвижная фаза:
Подвижная фаза A: вода.
Подвижная фаза B: 0,1 % (об/об) раствор ацетона.
| Время (мин) | Подвижная фаза A (% об/об) | Подвижная фаза B (% об/об) |
| 0–20 | 100 → 0 | 0 → 100 |
| 20–30 |
Скорость потока: необходимая для создания давления, достаточного для стабильной работы насоса (например, 2 мл/мин).
Детектор: Спектрофотометрический при длине волны 265 нм.
Определяют время (t0,5) в минутах, когда оптическая плотность увеличилась на 50 %. Вычисляют объем задержки
|
|
|
,
где: 
(в минутах);
tG – предварительно установленное время градиента (= 20 мин);
F –скорость потока (мл/мин).
Рисунок 6. Определение объема задержки градиента.
|
|
|
