Темновая репарация у грибов

Явление темновой репарации (ТР), которое вначале изучали на бактериях, состоит в восстановлении структуры ДНК, нарушенной облучением или воздействием любого другого неблагоприятного фактора.

Исследования механизма этого процесса были проведены в 60-х годах (Hill, Simson, 1961; Hanawalt, Haynes, 1965). Процесс репарации включает последовательное выявление участка поврежденной ДНК, разрез одной нити, выщепление поврежденного участка, расширение его эндонуклеазами, застройку бреши, соединение нового участка с основной нитью ДНК (Жестяников, 1968; Сойфер, 1969; Бреслер, 1973). Такой способ репарации назван эксцизионным. В 60—70-х годах этот феномен обнаружили у большого числа эукариотов, в том числе и у грибов. Обстоятельный обзор, посвященный ТР дрожжей, представили И. А. Захаров и др. (1979). Мы остановимся кратко на состоянии изученности этого вопроса на видах грибов, принадлежащих к другим классам.

Наиболее общим показателем наличия ТР является увеличение выживаемости облученной УФ- или γ-лучами споровой суспензии после выдерживания ее в воде (Корогодин, 1966; Bhattacharya et al., 1973; Василевская, 1976; Жданова та iн., 1977). Установлена зависимость степени пострадиационного восстановления (ПРВ) Saccharomyces vini штамма Мегри 131 после облучения γ-лучами от дозы, ее интенсивности, условий культивирования, организма, состава питательной среды (Корогодин, 1966). Экспозиция в темноте УФ-облученных конидий Aspergillus terreus приводила к увеличению их выживаемости и снижению количества мутаций (Bhattacharya et al., 1973). В дальнейшем появились сообщения (Василевская, 1976; Жданова, 1976; Жданова та iн., 1977), посвященные изучению этого явления на гифальном грибе Cladosporium transchelii и его цветных мутантах. Выживаемость γ- и УФ-облученных конидий после выдерживания в воде увеличивалась. При этом интенсивность процесса темновой репарации зависела от дозы облучения, увеличиваясь с возрастанием дозы γ-лучей от 200 до 600 крад. Статистически достоверных различий в уровне процессов ПРВ и ТР у цветных мутантов Ч-1 и БМ по сравнению с исходной культурой не обнаружено. Это обстоятельство послужило основанием для заключения об определяющем значении меланинового пигмента в их γ- и УФ-устойчивости.

Исследования Sommer et al. (1963, 1965) показали, что спорангиоспоры Rhizopus stolonifer, высеянные сразу после γ-облучения, только прорастали, но колоний не образовывали. При повышенной концентрации спор в воде прорастание их замедлялось, что способствовало более полному проявлению ПРВ. Выживаемость облученных спор при этом увеличивалась от 1% (исходный уровень) до 25—50%. Добавление хлорамфеникола (ингибитора белкового синтеза) угнетало восстановление от обратимых радиационных поражений.

Качественно новый этап в исследовании ТР представляет изучение изолированной УФ-облученной и необлученной ДНК с привлечением современных методов генетики, биохимии, биофизики, молекулярной биологии. Исследование темнового восстановления УФ-облученной ДНК Neurospora crassa проводили с применением игибиторов ТР — кофеина, частично подавляющего выщепление пиримидиновых димеров, и профлавина, полностью подавляющего этот процесс (Worthy, Elper, 1973). Основными этапами репарации УФ-облученной ДНК являлись выщепление образовавшихся димеров и восстановление однонитевых разрывов. С помощью седиментационного анализа определили молекулярную массу облученной ДНК, оказавшуюся на два порядка меньше по сравнению с необлученной. Применение ингибиторов выщепления димеров (кофеин, профлавин) и образования однонитевых разрывов (кинокрин) позволило выявить роль каждого из процессов в поражении ДНК. Анализ полученных данных позволяет заключить, что эти процессы локализованы в разных участках ДНК. О репарирующем синтезе судили по включению изотопа ³²Р. По мнению авторов, определяющим в устойчивости клеток гриба к УФ-облучению является время выщепления образовавшихся димеров. При быстром выщеплении клетка восстанавливается без повреждений, медленное восстановление может приводить к образованию мутаций или гибели клеток. С увеличением дозы облучения количество необратимых поражений нарастает и способность к репаративному синтезу снижается.

Изучение процесса выщепления пиримидиновых димеров у базидиомицета Ustilago maydis проведено Unrau (1975). Наряду с исходной культурой исследовали три УФ-чувствительных мутанта, два из которых были дефектны по рекомбинации и один — по выщеплению димеров. Исходная культура оказалась устойчивой к УФ-лучам: при дозе 300 Дж/м² выживаемость ее составляла более 90%. Подобно Neurospora crassa при малых дозах УФ-лучей (150—300 Дж/м²) у исходного штамма и мутантов, дефектных по рекомбинации, все димеры практически удалялись. С увеличением дозы облучения процесс замедлялся и появлялись остаточные димеры, у rec-мутантов выщепление происходило сразу после облучения и спустя 3 ч. Заметно отличалось поведение мутанта, дефектного по выщеплению димеров. Удаление димеров у него ингибировалось после доз выше 100 Дж/м², но при меньших дозах оно начиналось только после 1—2-часового латентного периода. В то же время выживаемость мутанта оставалась достаточно высокой. Автор выделяет два этапа в процессе репарации поврежденной ДНК Ustilago maydis: восстановление посредством выщепления пиримидиновых димеров, протекающее сразу после облучения и широко известное у бактерий и дрожжей, и рекомбинированное восстановление, которое зависит от белкового синтеза, оно начинается через 90—120 мин после облучения и заканчивается через 4—5 ч. Таким образом, в ряде случаев восстановление у эукариотов осуществляется значительно сложнее, чем у прокариотов. Unrau не сравнил свои результаты с известными в литературе, вследствие чего неясно, насколько процесс выщепления пиримидиновых димеров и репликации ДНК Ustilago maydis более интенсивен, чем у других грибов.

Проведено изучение ПРВ гриба Dictyostelium discoideum по критерию выживаемости исходного штамма и его мутантов (Deering, 1968). В работе, посвященной восстановлению УФ-облученной ДНК Dictyostelium discoideum использованы устойчивый и чувствительный к γ-излучению штаммы (ЛД₉₀ — 200 и менее 1 Дж/м² соответственно) (Gualis, Deering, 1976). Подобно Neurospora crassa и Ustilago maydis у обоих штаммов D. discoideum сразу после облучения заметно уменьшалась молекулярная масса ДНК, вследствие однонитевых разрывов, которые у резистентного штамма восстанавливались через 3,5 ч, а у чувствительного — через 12 ч. При дозе УФ-лучей 100 Дж/м² у обоих штаммов образовалось до 60% темновых димеров, из которых после 3-часовой инкубации в темноте оставалось только 15%, т. е. скорость удаления димеров у них одинакова. Наблюдаемые различия в устойчивости штаммов D. discoideum авторы связывают с нарушениями в репаративной системе, которые проявляются после вырезания пораженных участков ДНК при восстановлении. У чувствительного штамма, вероятно, нарушен также контроль координации между ферментом репарации и нормальным синтезом ДНК.

И. А. Захаров и др. (1979) обосновали целесообразность изучения механизмов ТР именно у дрожжей. Преимущества такого изучения состоят в том, что для дрожжей как одноклеточных простейших эукариотов применимы практически все генетические методы, известные для бактерий, что сделало возможным детальное изучение их генетики. Авторы предлагают называть пострадиационное восстановление восстановлением при задержке деления (ВЗД). Процесс ВЗД у эукариотов и прокариотов не одинаков. О существенных различиях свидетельствует удаление из облученной ДНК дрожжей димеров, а также потребность в синтезе белка при восстановлении от летальных повреждений у γ-облученных сахаромицетов. У бактерий аналогичный процесс может протекать при полном блокировании белкового синтеза. Если ВЗД у дрожжей подавлено, а ТР — нет, то при этом не наблюдается увеличения выживаемости УФ-облученных клеток. Таким образом, в процессе ТР димеры активно удаляются, но новые бреши в ДНК не ликвидируются. С другой стороны, систему ВЗД отличает от ТР способность репарировать различного типа повреждения.

Получены доказательства о наличии у эукариотов (в отличие от бактерий) трех путей репарации, из которых детально изучены два: эксцизионный и пострепликативная рекомбинация. О природе третьего пути репарации известно мало, но существует несколько гипотез по этому поводу. Так, Hannable, Cox (1971) считают, что он обусловлен темновой дорепликативной рекомбинацией; Brendel, Haynes (1973) полагают, что восстановление от повреждений, индуцированных γ-лучами, должно осуществляться не так как при восстановлении от повреждений, вызванных УФ-лучами.

Следует заметить, что исследования подобного рода проведены на одном виде дрожжей — Saccharomyces cerevisiae.

Известные механизмы репарации объясняют ликвидацию одноцепочных разрывов ДНК. Однако ионизирующие излучения большей частью вызывают разрывы двух цепочек ДНК, которые во многих случаях не репарируются. Исследование природы радиоустойчивости таких высокоустойчивых организмов, как Micrococcus radiodurans, заставило предположить существование у него механизмов восстановления разрывов двух цепочек ДНК (Жестяников, 1968). Noseley, Copland (1975) считают, что в основе такого восстановления М. radiodurans лежит процесс рекомбинации. Способность к репарации двойных разрывов ДНК установлена также у эукариотных организмов — на культуре клеток млекопитающих и на дрожжах Saccharomyces cerevisiae. В работах В. К. Королева, Л. М. Грачевой (1972) и Resnick (1976, цит. по Захарову и др., 1979) приведена схема репарации разрывов ДНК у S. cerevisiae. Первой ступенью репарации авторы считают узнавание концов разрыва нитей ферментом 5’→3′ — экзонуклеазой. Затем происходит ограниченная деградация нитей ДНК, которая разнонаправлена в пораженных нитях ДНК. Она сопровождается образованием гетеродуплекса, который не препятствует репликации ДНК. В результате образуется одна неповрежденная хроматида, а у второй разрывы (бреши) ликвидируются включением ферментов темновой репарации (ДНК-полимеразы, лигазы). Кроме того, предусматривается второй возможный путь репарации, при котором два гетеродуплекса формируются в результате гибридизации двух нитей неповрежденных хроматид с таковыми поврежденной. После образования гибридных молекул ДНК происходит их рекомбинация. Последний процесс, по данным В. Г. Королева, Л. М. Грачевой (1972), у сахаромицетов встречается значительно чаще.

Удачным объектом для исследования репаративных свойств ДНК в митохондриях оказались сахаромицеты, большинство которых относится к факультативным анаэробам. Под влиянием УФ- и ионизирующего излучения у них получены так называемые дыхательные, или «petit» — мутанты, отличающиеся слабым ростом и удобные для идентификации. Возникновение таких мутантов обусловлено нарушениями в митохондриальной ДНК при облучении (Ephrussi, 1953; Moustacchi, Enteric, 1970). Выращивая УФ-облученные клетки Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoides на средах с глюкозой и пируватом, Hixon et al. (1975) наблюдали увеличение количества колоний в условиях задержки деления, свидетельствующее о репарационных процессах в ядерной и митохондриальной ДНК. Эти эффекты удалось разделить, выдерживая облученную малой дозой УФ-лучей клеточную суспензию в воде. При этом наблюдали снижение количества карликовых мутаций, тогда как число нормальных колоний увеличивалось. Добавление кофеина в инкубационную систему стабилизировало количество «petit» мутаций, что происходит вследствие репаративных процессов в ДНК митохондриального происхождения. С увеличением дозы излучения число мутаций линейно увеличивалось. Авторы полагают, что значение митохондриальной ДНК с увеличением времени облучения возрастает.

В результате широкого изучения радиочувствительных мутантов рода Saccharomyces была экспериментально подтверждена гипотеза Лобашева (1963), согласно которой мутации возникают как ошибки репарации. Таким образом, биологическое значение системы репарации в нормальных условиях жизнедеятельности состоит в поддержании стабильности генетического материала клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Знания о влиянии света на грибы используют на грибных фермах, для увеличения выхода биомассы (Пример: выращивание вешенок)

Зная нужный спектр и мощность света, возможно увеличить продукцию грибного меланина, т.к грибной меланин является мощными природными антиоксиданом

(В настоящее время уже производятся мази от кожных заболеваний, в которых используется меланин, полученный из грибов)

Возможность соотнести различные физиологические и биохимические процессы с фотопериодизмом грибов, и использовать эти знания для применения в биотехнологии и биоинженерии.

(Один из путей применения полученных знаний о биолюминесцентной системе грибов – создание высокочувствительных биотестов, для анализа загрязнений почвенных образцов)