Метод выделения и культивирования хламидий.

Выделение хламидий из исследуемого материала проводят на куриных эмбрионах, культуре клеток. Чаще всего для выделения хламидий используют заражение куриных эмбрионов суспензией исследуемого материала.

Исследуемый материал (пробы паренхиматозных органов, лимфоузлов и других тканевых материалов) нарезают мелкими кусочками в стерильную фарфоровую ступку, используя стерильные инструменты. В ступку добавляют стерильный песок и растирают пестиком до получения однородной кашицы. Затем, путем добавления физиологического раствора получают 10 - 20% -ную суспензию. Для удаления грубых частиц суспензию фильтруют, фильтрат центрифугируют при 2 - 3 тыс. об/мин. в течение 25 - 30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают пенициллином из расчета 100 ЕД/мл и стрептомицином 500 ЕД/мл и гентамицином 150 мкг/мл.

Пробы спермы, эйякулята, влагалищной слизи используют в неразведенном виде или разводят 1:2 физраствором и обрабатывают антибиотиками. Надосадочную жидкость, пробы спермы, эйякулята, влагалищной слизи высевают на МПБ, МПА, среду Китта-Тароцци и выдерживают посевы в термостате 48-72 часа для исключения бактериального загрязнения. При отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал используют для заражения куриных эмбрионов.

Куриные эмбрионы заражают в желточный мешок или хорион-аллантоисную оболочку, Яйца должны быть получены от кур, в рацион которых не добавляли антибиотики. Оптимальный возраст эмбрионов для заражения 6-7 суток. Доза для заражения составляет 0,2 - 0,5 мл исследуемого материала. Эмбрионы инкубируют в термостате при 37°С и овоскопируют ежедневно. Гибель эмбрионов в 1-ые двое суток считают неспецифической. Специфическая гибель их начинается на 3 - 4-ые сутки и может регистрироваться до 10 - 12-ого дня.

При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 12-й день вскрывают и проводят пассаж по описанной выше методике. Рекомендуется проводить не менее трех последовательных пассажей, используя при этом центрифугат 10 - 15% сузпензии желточных мешков.

Погибшие эмбрионы вскрывают, желточные мешки отбирают и готовят из них препараты-отпечатки. Аллантоисную жидкость проверяют на стерильность путем высева на обычные питательные среды.

Препараты окрашивают и микроскопируют. Результат считают положительным в случае обнаружения хламидий в препаратах, приготовленных из желточных мешков куриных эмбрионов любого из 3-х пассажей.

Хламидии из исследуемого материала можно выделять путем внутрибрюшинного, интраназального, интрацеребрального, интраторокального заражения морских свинок. Наиболее приемлимым является внутрибрюшинный способ заражения в дозе 0,5 мл 10%-ной суспензией паренхиматозных органов, приготовленной по методике описанной выше (как для заражения куриных эмбрионов).

Лабораторные животные гибнут на 5 - 10 сутки после заражения. В случае выживания животных, их убивают, из паренхиматозных органов делают 10%-ную суспензию, которой заражают новую партию морских свинок. Необходимо провести не менее 3-х последовательных пассажей, как и на куриных эмбрионах.

Результат исследования считают положительным при обнаружении хламидий в препаратах-отпечатках из органов павших лабораторных животных в любом из 3-х последовательных пассажей с помощью световой и люминесцентной микроскопии.

Для культивирования хламидий используют первичные и перививаемые культуры клеток (McCoy, L-929, HeLa). Заражение культуры клеток проводят метериалом, полученным соскобом со слизистых оболочек или суспензией из паренхиматозных органов. Исследуемый материал помещают во флаконы со стеклянными бусами, содержащими: 2 мл среды 199 с 5% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 45% 0,5М раствора глюкозы. Для подавления бактериальной микрофлоры в исследуемый материал добавляют стрептомицин (200 мкг/мл), канамицин (100 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл). Экспозиция с антибиотиками составляет от 3 до 18 часов, при температуре 4°С, после чего материал вносят по 0,3 мл в пробирки с монослоем клеток. На каждую пробу используют не менее 4-х пробирок с культурой клеток. Одновременно ставят контроли:

.   контроль монослоя в норме;

.   контроль монослоя, инфицированного эталонным штаммом;

.   контроль монослоя, зараженного экстрактом ткани аналогичной исследуемому материалу, но не содержащей хламидий.

Культуры клеток ежедневно микроскопируют с целью обнаружения цитопатического действия (ЦПД).

Серологический метод

Хламидии имеют групповой термостабильный антиген, который выявляют в серологических реакциях: РСК, РДСК, РНСК, РНГА, ИФА. Наибольшее применение в практике получила РДСК, основанная на выявлении специфических антител в сыворотке крови абортировавших свиноматок (нарастание титра в 2 и более раз). Абортировавших свиноматок исследуют дважды. Кровь от свиноматок берут в день аборта и спустя 21 день после него. С помощью РСК проводят массовое обследование поголовья, что позволяет выявлять бактерионосителей и оценивать эпизоотическую ситуацию в хозяйстве. Наличие комплементсвязывающих антител к хламидийному антигену в низких титрах - показатель инфицированности животных.

Постановку РДСК осуществляют согласно «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции сельскохозяйственных животных», утвержденным ГУВ МСХ СССР 15.04 1986 г. Для постановки РСК Российский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности выпускает «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных».

В Республике Беларусь разработаны «Методические указания по постановке реакции непрямого связывания комплемента при серологической диагностике хламидийных инфекций у животных» (Фомченко И.В., Максимович В.В., Тюликов С.И.).

Методические рекомендации по постановке реакции непрямого связывания комплемента в серологической диагностике хламидийных инфекций у животных.

.   Сущность РНСК заключается в том, что неполные (блокирующие) антитела, содержащиеся в сыворотке крови больных или переболевших животных образуют комплекс антиген-антитело, не связывая комплемент, поэтому они не могут быть обнаружены методом РДСК. Для выявления таких антител в реакцию вводят дополнительный компонент в виде позитивной сыворотки, содержащей полные антитела против возбудителя хламидийной инфекции (условно-индикторная сыворотка). При наличии в испытуемой сыворотке неполных антител их взаимодействие с антигеном происходит без участия комплемента, который оставшись свободным обеспечивает гемолиз эритроцитов в гемолитической системе (реакция положительная). Если испытуемая сыворотка не содержит неполные антитела, то антиген соединяется с антителами введённой позитивной (индикаторной) сыворотки, образуя комплекс антиген-антитело-комплемент, в результате гемолиз эритроцитов не произойдёт (реакция отрицательная).

.   В РНСК используют следующие компоненты: комплементсвязывающий группоспецифический хламидийный антиген, контрольный антиген, позитивную (иммунную) сыворотку крови содержащую группоспецифические хламидийные антитела, негативную (отрицательную) сыворотку крови, комплемент (свежая консервированнаяили лиофильно высушенная сыворотка крови морской свинки), гемолизин, эритроциты барана, испытуемые сыворотки, физиологический раствор. Специфический и контрольный антигены, позитивную и негативную сыворотки изготавливают биофабрики, выпускающиеих в специальных наборах. Антиген применяют в РНСК и РДСК в рабочих титрах, указанных на этикетке.

3. Гемолизин в РНСК используют в удвоенном титре.

.   Эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об/мин в течение 10-15 минут до полной прозрачности надосадочной жидкости. Для РНСК применяют 2,5%-ную взвесь эритроцитовиз осадка.

5. Приготовление гемолитической системы. Перед работой смешивают одну часть 2,5%-ной взвеси эритроцитов и одну часть гемолитической сыворотки в удвоенном титре. Полученную гемолитическую систему ставят в водяную баню (термостат) при 37°С на 30 минут для сенсибилизации. Во время работы гемолитическую систему хранят при комнатной температуре или в холодильнике при 2-4°С.

6. Для серологического исследования пригодны свежие испытуемые сыворотки. Допускаются к исследованию и замороженные (однократно). Мутные, проросшие или гемолизированные сыворотки для исследования непригодны.

.   Физиологический раствор для разведения компонентов (0,85%-ный растворхимически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде, рН 7,2-7,4) готовят и кипятят в течение 5 минут за день или в день постановки реакции.

.   Титрование комплемента. Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором до первоначального объема, указанного на этикетке и готовят основное разведение 1:20. Каждую сыворотку, разведённую 1:5 (1 мл сыворотки + 4 мл физиологического раствора) и инактивированную при 58-60°С 30 минут, разливают по 0,2 мл в два ряда пробирок штатива Флоринского.

Титрование комплемента начинают с дозы 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом по 0,02 мл. Добавляют в каждую пробирку недостающее до 0,2 мл количество физиологического раствора. В первые ряды пробирок с позитивной, негативной и испытуемыми сыворотками (взятыми из опыта) разливают специфический антиген в рабочем разведении по 0,2 мл и по 0,2 мл физиологического раствора, а во вторые ряды по 0,4 мл физиологического раствора. Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 60 минут при 37-38°С. Затем во все пробирки разливают гемолитическую систему по 0,4 мл, встряхивают и ставят в водяную баню на 30 минут при 37-38°С.

Титром (единицей) комплемента считают наименьшую дозу его, которая дает полный гемолиз эритроцитов с негативной и испытуемыми сыворотками в пробирках первого и второго рядов и с позитивной сывороткой - в пробирках второго ряда (без антигена). В примере, приведенном в таблице 2, титр комплемента, разведенного 1:20, равен 0,1 мл, что и будет являться его рабочейдозой.

Примечание: если в первом ряду пробирок с сыворотками из опыта получена ясно выраженная задержка гемолиза эритроцитов более чем на два интервала по сравнению с безантигенным рядом, это значит, что испытуемые сыворотки содержат специфические (к данному антигену) антитела. И в таком случае рабочую дозу комплемента определяют по негативной сыворотке и безантигенным рядам позитивной и испытуемых сывороток.

Расчет количества чистого комплемента, необходимого для постановки главного опыта, делают по формуле:

 

Х=АхВ/С,

 

где А - рабочая доза комплемента, В - количество пробирок, занятых в реакции, С - основное разведение комплемента.

Пример: 0,1х100/20=0,5. Количество разведенного комплемента, требуемое для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 мл (0,2х100), поэтому к 0,5 мл чистого комплемента следует добавить 19,5 мл физиологического раствора.

.   Главный опыт РНСК. Сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 со специфическим антигеном, 1:5 с контрольным антигеном и без антигена. Реакция протекает в три этапа. На первом этапе инкубируют испытуемые сыворотки со специфическим антигеном в дозах по 0,2 мл в течение 60 мин при 37-38°С. На втором этапе в реакцию вводят дополнительно позитивную (индикаторную) сыворотку, разведенную физиологическим раствором до предельного титра, по 0,2 мл, и одновременно во все пробирки разливают комплемент по 0,2 мл в рабочем разведении согласно результату титрования его. Смесь (испытуемая сыворотка, антиген, позитивная индикаторная сыворотка и комплемент) инкубируют в течение 60 мин при температуре 37-38°С. На третьем этапе добавляют гемолитическую систему по 0,4 мл и реакцию выдерживают 30 мин в водяной бане при 37-38°С.

10. Контроли главного опыта РНСК. Контроли негативной и позитивной сывороток для каждой реакции ставят в двух вариантах: в одном варианте на втором этапе добавляют во все пробирки 0,2 мл индикаторной сыворотки, а во втором - 0,2 мл физиологического раствора. Контроли антигена и гемолитической сыворотки ставят с добавлением во все пробирки 0,2 мл физиологического раствора.

.   Учёт реакции.

 

Таблица 1. Процент гемолиза.

Компоненты	Номера пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Гемолизированая жидкость, мл	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
Физиологический раствор, мл	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1
Процент гемолиза	10	20	30	40	50	60	70	80	90

 

 

Из реакции выбирают пять пробирок, где произошёл 100%-ный гемолиз эритроцитов, их содержимое сливают в одну пробирку. Из её готовят разведение с меньшим процентом гемолиза по схеме (см. таблицу 1) и готовят перед учётом реакции.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путём сравнения со степенью гемолиза в стандартных пробирках. Процент гемолиза выражают в крестах.

+ + + + - гемолиз эритроцитов 0-10%

+ + + - гемолиз эритроцитов 10-40%

+ + - гемолиз эритроцитов 40-70%

+ - гемолиз эритроцитов 70-90%

- гемолиз эритроцитов 90-100%

Учёт реакции РНСК проводят визуально дважды: первый раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (3-4 часа после бани).

Оценка результатов по проценту гемолиза:

Положительная - от двух крестов до полного гемолиза в разведении 1:10.

Сомнительная - в разведении 1:5 от трёх крестов до полного гемолиза эритроцитов, в разведении 1:10 на три креста.

Отрицательная - четыре креста в разведениях 1:5 и 1:10.

Дважды сомнительная считается положительной.

При выделении положительной сыворотки в реакции проводится раститровка её до предельного титра (см. положительный контроль).

В случае нарастания титра антител в парных пробах сыворотки в два и более раза диагноз считается установленным серологическим методом.

Иммуноферментный анализ применяют для ретроспективной диагностики хламидиоза. Используют твердофазный метод в направлении идентификации антигена и антител.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с псоледующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызывать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

Техника постановки ИФА

Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудование:

В состав набора входят:

специфический антиген хламидиозный, лиофилизированный - 1 амп.;

специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;

отрицательная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;

пероксидазный антивидовой конъюгат,, лиофилизированный -1 амп.;

Химический набор, в состав которого входят:

КН₂ РО₄ - 1 амп.;

К₂НРО₄ - 1 амп.;- 1амп.;

Твин - 20 (-40,-80, Тритон Х- 100) - 1 амп.;

Лимонная кислота - 1 амп.;

К₂НРО₄ - 1 амп.;

О- фенилендиамин 2 амп.;

гидроперит - 1 табл.;

две 96- луночные полистироловые планшеты с плоским дном для ИФА;

стоп- раствор - 1 флакон.

Оборудование:

одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом от 0,05 см³ до 1 см³;

стеклянные пипетки на 1-2 см³;

промывающее устройство;

спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм.

Приготовление рабочих растворов:

Буфер № 1 - (0,01М калий фосфатный, рН 7,2 - 7,4) предназначен для растворения антигена. Содержимое ампул 5,6,7 растворяют в 2500 см³ дистиллированной воды, фильтруют, проверяют рН. При необходимости рН корректируют 0,1 N КОН или НСI.

Буфер №2 - предназначен для растворения сывороток, конъюгата, а также для промывки микропанелей. К 2000 см³ буфера №1 добавляют содержимое ампулы №8.

Буфер №3 - (фосфатно- цитратный) предназначен для приготовления субстрата (рН 5,0 - 5,2). Состоит из двух компонентов: А и Б.

А - содержимое ампулы №9 растворить в 50 см³ дистиллированной воды в мерной колбе.

Б - содержимое ампулы №10 растворить в 50 см³ дистиллированной воды в мерной колбе, затем к 24,3 см³ раствора А добавить 25,7 см³ раствора Б и 50 см³ дистиллированной воды, проверить рН. В случае необходимости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) буфера до установления требуемого рН. Изменение цвета субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является следствием использования для его приготовления недостаточно чистой посуды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно перед использованием, хранению не подлежит.

Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непосредственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления реакции на последней стадии. Содержимое ампулы №11 растворить в 2 см³ спирта-ректификата и добавить 48 см³ буфера №3, внести 0,8 см³ перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки №12 в 10 см³ дистиллированной воды.

Буферные растворы хранят при температуре 4-6° С не более 3 мес.

Подготовка биологических компонентов реакции:

Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 20 см³ буфера №1.

Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 см³ буфера №2.

Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 см³ буфера №2 получая разведение 1:200.

Растворенный антиген, сыворотки, антивидовой конъюгат хранят при 4-6° С в течении 3-4 дней.

Разведение проб сыворотки крови.

Испытуемую сыворотку крови разводят 1:200 буфером №2 в отдельных пробирках или микропанели.

Постановка иммуноферментной реакции.

Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.

Сорбция антигена на микропанели.

Промывание микропанели.

Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Каждую лунку заполняют буфером №2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхивают. Промывание повторяют 4-5 раз.

Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое промывающее устройство.

Разведение сывороток.

В три лунки микропанели вертикального ряда А₁, В₁, С₁, вносят по 0,1 см³ специфической положительной сыворотки (положительный контроль), а в три следующие лунки D₁, E₁, F₁ вносят по 0,1 см³ отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены согласно п.3.4.2. В лунки G₁, Н₁, которые служат контролем субстрата, вносят по 0,1 см³ буфера №2. В горизонтальные ряды А, Е вносят, начиная с лунок А₂ и Е₂ по 0,2 см³ исследуемых парных проб сыворотки, подготовленных как указано в п.3.4.3. и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с разведения 1:200 до 1:6000.

Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37°С в термостате в течении часа.

Внесение конъюгата.

Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.

Во все лунки вносят по 0,1 см³ рабочего раствора иммуноферментного конъюгата подготовленного согласно п.3.4.2., и инкубируют в термостате при 37°С в течении 1 часа.

Промывают 5 раз как указано в п. 3.5.2.

Проявление реакции.

Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4.1.

Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 см³ субстратно-индикаторный раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30-40 мин.

В каждую лунку вносят по 10 мкл стоп-раствора.

Учет результатов реакции.

Результаты учитываются в течении 30-40 мин. после внесения стоп-раствора.

Визуальный учет: при наличии специфических антител наблюдается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле.

Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотности (ОП490).

Положительными считаются пробы, ОП490 которых в два и более раза превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.

Сомнительные пробы - ОП 490 которых выше отрицательного контроля и составляют 0,150-0,199 оптических единиц.

Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свидетельствуют об отрицательной реакции.

Интерпретация результатов ИФА.

Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических и патологоанатомических признаков заболевания.

Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и при подтверждении первоначального результата считаются положительными.

Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.

⇐ Предыдущая123456Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: