 |
Молекулярно-генетический метод.
|
|
|
|
Метод предназначен для выявления ДНК хламидий с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР в патологическом материале от животных.
Суть ПЦР заключается в амплификации, т.е. увеличении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК или РНК (праймеров) искомого агента in vitro с последующей индикацией амплификона (амплифицируемый участок ДНК) методом электрофореза или другим методом.
ПЦР позволяет идентифицировать возбудитель в количестве 1 бакт. клетки в пробе, специфичность 100%.
В ПЦР используют следующие наборы:
набор для выделения ДНК (набор № 1);
набор для проведения ПЦР (набор № 2);
набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (набор № 3);
набор контрольных образцов (набор №4).
Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:
лизирующий раствор -1 пробирка, 30 см3;
отмывочный раствор №1-1 пробирка, 20 см3;
концентрат для отмывочного раствора №2 -1 пробирка, 20 см3;
суспензия сорбента - 2 пробирки по 2 см3;
буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5 см3.
Набор.для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:
смесь праймеров "Chla" -1 пробирка, 0,25 см3;
смесь нуклеотидов - 1 пробирка, 0,25 см3;
5-кратный реакционный буфер -1 пробирка, 0,5 см3;
деионизованная вода -1 пробирка, 1 см3;
фермент Taq-полимераза -1 пробирка, 0,05 см3;
воск для ПЦР -1 пробирка, 1,0 см3;
масло минеральное -1 пробирка, 5,0 см3.
Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из следующих компонентов:
концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25 см3;
агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2 г.
Набор контрольных образцов состоит из следующих компонентов:
ОКО (отрицательный контрольный образец) -1 пробирка, 1 см3;
|
|
|
положительный контрольный образец для ПЦР- К+ ДНК (ДНК Chlamydia psittaci) - 1 пробирка, 0,1 см3.
Отбор материала для исследования. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.
Для исследования используют:
паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, кусочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг абортированных плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производителей, подозрительных по заболеванию, соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта).
Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 см3, из тканей и органов вырезают кусочки размером 3х3х3 см3 (при невозможности толщина кусочков может быть меньше).
Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при 4 °С. Допускается хранение материала при минус 20 °С в течение 30 дней. Пробы мочи доставляют в тот же день.
Подготовка исследуемого материала
Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипе-точными дозаторами переменых объёмов (типа "Ленпипет") с использованием одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 см3 и 10,0 см3 (ПО "Ленполимер") и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.
Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 см3 центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. При необходимости объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора. Супернатант осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,2 см3 жидкости. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 см3 материала и повторяют центрифугирование. Осадок суспендируют в оставшейся надосадочной жидкости (или физиологическом растворе) и 100 мкл его используют для выделения ДНК.
|
|
|
Пробы паренхиматозных органов, плодовых оболочек, размером 3х3х3 мм3 помещают в пробирки типа "эппендорф", тщательно растирают отдельными стеклянными палочками, добавляют по 1 см3 физиологического -раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при температуре 20-25°С в течение 20 мин, после чего 100 мкл верхней фазы используют для выделения ДНК.
Сперму в объеме 0,5 см3 разводят равным объемом физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 10000-12000 об/мин в течение 8-10 мин, осадок ресуспендированный в 100 мкл физиологического раствора используют для выделения ДНК.
Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5-1,0 см3 физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 11000-12000 об/мин в течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК. Если слизь очень густая (не всасывается в отверстие наконечника пипетки), то пробу обрабатывают 1-2 см3 раствора 0,1М меркаптоэтанола, добавив его в "эппендорф". Размешивают на вортексе, выдерживают при комнатной температуре 3-5 мин и центрифугируют в вышеуказанном режиме. Осадок в 100 мкл физиологического раствора используют для выделения.
Проведение ПЦР-анализа. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), для работы, в которых дополнительно требуются следующие материалы и оборудование:
Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1:
настольный бокс с бактерицидной лампой;
термостат для, пробирок типа "эппендорф" на 25-100 °С;
микроцентрифуга до 12000-16000 об/мин;
центрифуга/вортекс "Микроспин";
отдельный набор автоматических пипеток переменого объема от 0,001 см3 до 1 см3;
одноразовые наконечники с аэрозольным барьером;
одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 см3 типа "эппендорф";
штативы для пробирок, наконечников;
отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
холодильник на 2-8 °С с морозильной камерой.
Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2;
|
|
|
амплификатор;
ПЦР-бокс или отдельный стол с УФ-лампой;
отдельный халат и одноразовые перчатки;
отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от 0,001 см3 до 1см3;
одноразовые наконечники в штативах;
одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 см3;
штативы для микропробирок на 0,5 см3;,
холодильник на 2- 8 °С, морозильник на минус 20 °С для выделенных ДНК;
термостат для микропробирок с воском на 95 °С.
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3:
камера для горизонтального электрофореза;
источник постоянного тока на 150-200 В;
ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей;
фотоаппарат для фотографирования гелей и, фотопленка;
бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
аквадистиллятор;
отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;
мерный цилиндр на 1л;
колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;
электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.
Порядок работы.
ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала.
Выделение ДНК из 100 мкл подготовленного материала проводят с помощью набора №1. Предварительно готовят отмывочный раствор №2, смешав в отдельном флаконе 20 см3 концентрата из набора, 80 см3 дистиллированной воды и 100 см3 96% этилового спирта. Смесь хорошо перемешивают и хранят при температуре 20-22 °С под плотна закрытой крышкой.
Проверяют состояние сорбента - при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии. После этого приступают к выделению ДНК.
В ряд полипропиленовых пробирок объемом 1,5 см3 вносят по 100 мкл предварительно подготовленных исследуемых проб, а также по 100 мкл контрольных проб 1-го этапа анализа ("контролей выделения"): отрицательные пробы - элюи-рующий буфер и физиологический раствор (последний вносят в случае подготовки пробы с его использованием), положительная проба - ДНК Chlamydia (из набора №4), разведенная 1:10 элюирующим буфером. Добавляют по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником с аэрозольным барьером) и тщательно пипетируют 5-10 раз до полного лизиса пробы, стараясь при этом не вспенивать раствор. Прогревают пробирку 5 мин при 65 °С, тщательно перемешивают на вортексе до полного растворения материала. Добавляют 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в каждую пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают. содержимое пробирки на вортексе и оставляют в штативе на 2 мин для осаждения сорбента, еще раз перемешивают и отстаивают 5-7 мин. Осаждают сорбент на "Микроспине" в течение 30 сек и отбирают супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос с колбой-ловушкой для отбираемой жидкости). Добавляют по 200 мкл отмывочного раствора №1, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования (если сорбент плохо разбивается, тогда его разбивают при помощи наконечника пипетки), осаждают на "Микроспине" в течение 30 с и отбирают супернатант. Добавляют по 800 мкл отмывочного раствора №2, перемешивают на вортексе до полного ресуепендирования сорбента, осаждают на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение 30 с, отбирают супернатант. Повторяют процедуру отмывки раствором №2, тщательно отбирают супернатант и высушивают осадок сорбента при открытых крышках пробирок в термостате при 65 °С, в течение 5-7 мин. Добавляют 50 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в термостат при 65 °С на 5 мин, встряхивая на вортексе через каждую минуту. Осаждают на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение минуты. Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.
|
|
|
Подготовить положительный контрольный образец для ПЦР, для чего развести К+ ДНК в 100 раз в буфере для элюции ДНК и вместе с ДНК-пробами перенести в комнату для постановки ПЦР.
ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).
Пробирку с воском ставят в термостат при 95 °С до полного расплавления. Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя стерильные наконечники (полистирол выдерживает автоклавирование при 120 °С):
для амплификации ДНК Chlamydia: к 0,25 см3 праймеров "Chia" добавляют 0,25 см3 нуклеотидов, смешивают на вортексе;
Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси, наслаивают сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость, закрывают крышки, на верхней части которых наносят пометки "Chia", Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают -пробирки в амплификаторе 5 мин при 95 °С и охлаждают. В таком виде, пробирки хранятся в морозильнике -несколько месяцев, можно приготовить сразу 50-100 штук.
|
|
|
Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 см3 5-кратного реакционного буфера добавляют 0,45 см3 деионизованной воды и 0,05 см3 Taq-полимеразы, хорошо перемешивают на вортексе. Смесь хранится при 2-8 °С в течение месяца (не замораживать!). Выставляют ряд пробирок с "нижними" смесями ("Chia") в штатив по числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли выделения"), и добавляют пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода и ДНК Chlamydia, разведенные деионизованной водой 1:10), нумеруют их. Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с "нижней" смесью. Сверху раскапывают по 1 капле масла. Под масло вносят по 10 мкл проб -испытуемых и контрольных и 10 мкл К+ ДНК, подготовленной для постановкиПЦР, т.е. разведенной 1:100 буфером для элюции. Для отрицательного контроля амплификации вместо ДНК-пробы добавляют 10 мкл деионизованной воды (из набора №2)..Набирают на амплификаторе нужную программу:
| Амплификаторы с регулированием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения - не менее 1° С/сек:) "MiniCycler", "РТС-100" (MJ Re-search) | Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке): "GeneAmp PSR System 2400" (Рег-kin Elmer); "Omn-E” (Hibaid); "Терцик" (ДНК-технология) |
| 95°С- пауза 95° С - 2мин 1 цикл 95 °С-45с 62°С-45с} 40циклов 72 °С - 45 с 10 °С -12-14 час (хранение) | 95° С - пауза 95°С - 2мин 1 цикл 95 °С-10 с 62 °С-10 с} 40циклов 72°С-10 с 10 °С -12-14 час (хранение) |
Через 1-2 мин после запуска программы, (когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 °С), ставят программу на паузу, помещают пробирки в ячейки, закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут окончания реакции (примерно 2,5 часа на амплификаторе с регулированием температур по матрице и 1 час 40 мин на амплификаторе с активным регулированием). После окончания реакции (в тот же день или после хранения утром следующего дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в комнату для анализа продуктов ПЦР, который проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.
Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:- ЗОО п.н.
ЭТАП 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР.
Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующий метод полимеразнрй цепной реакции).
В мерный цилиндр наливают 25 см3 концентрированного буфера, доводят дистиллированной водой до 500 см3, закрывают цилиндр парафинированной пленкой ("PARAFILM") и перемешивают. Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из термостойкого стекла объемом 250 см3, наливают 100 см3 готового буфера и плавят на кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого кипятят агарозу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу. Заливают агарозный гель в форму (толщина 5-6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга.
После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре) осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки. Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лунки были обращены в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок будет двигаться к положительному электроду). Наливают приготовленного буфера столько, чтобы он покрыл гель на 4-5 мм. Выставляют пробирки с продуктами амплификации последовательно в штатив. Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и вносят на дно лунки Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пипетируя 1 -2 раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того момента, как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину длины геля. Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок (одна под другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК под ультрафиолетовым излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной).
Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в проходящем ультрафиолете на чувствительную пленку типа "Микрат 300" или поляроидную пленку. Документирование результатов можно проводить с помощью других систем: Insta Doc I, Insta Doc II (фотографирующие), Gel Doc 1000 или Шатер ДВ (компьютерные).
Учет и интерпретация результатов. В дорожке соответствующей положительному контрольному образцу должна быть яркая специфическая светящаяся оранжевая полоса на уровне 300 п.н. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящеюся полосу большей или меньшей интенсивности на уровне 300 п.н.
В дорожке, соответствующей отрицательному контрольному образцу не должно быть каких-либо полос. Отрицательными считаются образцы, которые не содержат специфической полосы 300 п.н.
Кроме полосы 300 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п. (в нижней части дорожки).
При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса отсутствует.
Результаты анализа не учитываются, если:
в дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повторить исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина - ошибка на первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очистке от ингибиторов реакции.
в дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая полоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы. Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР для выявления источника контаминации. Если результат повторяется, необходимо сменить реактивы.
в дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: неправильное проведение "горячего старта" или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.
Идентификация хламидий
Идентифицируют хламидии и их антигены методами световой и люминисцентной микроскопии (РИФ), в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА или с помощью ПЦР.
Диагноз на хламидиоз считают установленным в одном из следующих случаев:
. При выделении возбудителя из исследуемого материала и его идентификации;
. При получении нарастания титра антител в парных пробах сыворотки крови больных или переболевших животных в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА в два и более раз;
. При выявлении ДНК хламидий в ПЦР.
При диагностике хламидиоза предусмотрены следующие сроки исследований:
выявление специфических антител - от 1 до 5 дней;
световая микроскопия - от 30 минут до 2 часов;
люминесцентная микроскопия - до 3 часов;
выделение и идентификация хламидий - от 7 до 40 дней;
выявление ДНК хламидий - от 4 часов до 2 суток.
|
|
|
